【原创】我与我的WB实验二三事--在失败中成长

今天想在这里分享自己做实验时碰到的几件事情。

事件（一）一个失败的尝试

我不知道有多少人提取过大鼠睾丸组织总蛋白，我是第一次做这样的实验。睾丸组织跟其他组织很不一样，从负80度拿出来以后，很快就解冻，会变得跟一滩水一样，想用天平称量很不方便，尤其是在我们只需要不超过20毫克组织的时候。当时，为了做好定量，也就是保证每个样本取到相同质量的组织，我做了一个大胆的尝试，先剥掉表面那层膜，接着除去肉眼可见的小血管，最后把整个睾丸组织全部用玻璃匀浆器匀浆了，这样每次要提取总蛋白的时候，我就用移液枪在每个样本中取相同体积的组织（可以把*头剪掉一小截，这样更容易吸取），就可以保证它们的质量大致相同了，拿这样的样本去提取总蛋白，得到的总蛋白浓度应该相差不多，对于后面做WB实验当然很有帮助。我本来以为这是一个非常天才，非常创新的做法，然而，实际效果却很打脸。事实证明，把组织匀浆了以后保存在负80度跟以完整的组织形态保存在负80度相比，效果很不一样，我们通过对比发现，匀浆以后保存的组织，其内的总蛋白发生了明显降解，很多地方的条带直接消失了，可以看到的条带也非常模糊。做科研确实要敢于尝试，通过这次失败的尝试，我就得到了重要的经验，我觉得虽然费了些时间，不过挺值得。

事件（二）匀浆仪匀个浆，管子竟然破了两个

我起初真的以为匀浆仪应该是很简单的。组织泡在裂解液里，加点PMSF，加两三颗磁珠进去，不就行了吗？我是这么想的，也是这么做的，结果那天晚上匀浆的过程中，直接破掉了两个管子。事情比较复杂曲折，简单地归纳一下就是，不是所有的磁珠都可以配所有的管子的。搭配不好，管子真的会碎。不一定是管子质量问题，别人用的好好的，你用就碎了，就说明问题可能不在管子，而是自身操作方面有问题，所以，即使是面对一个貌似很简单的仪器，也要认真地看看说明书，再动手。如果实在找不到原装的说明书，就去网上找找，或者找一个会用的人仔细问问。我运气比较好，后来得到一位老师的指点，才知道很多细节是需要注意的，比如不同的组织需要用到不同的参数，效果可能不完全一样，磁珠的搭配也是有讲究的，有一些时候还需要摸索最佳的组合条件。看似简单的仪器，真想用好，也得用心去学习。

事件（三）选了个内参，结果发现它对实验处理不稳定

做过WB的人，一定都选过内参。我当时选择的内参是GAPDH。抗体回来以后，我看了一下说明书，上面写到这个蛋白的代谢会受到缺氧和糖尿病的影响。我自己做的是高温模型，我就想，说明书上并没有讲到它会受到高温影响，那选择这个蛋白做内参应该没有太大问题。但是后来做实验的过程中，我们却意外地发现，GAPDH对高温处理很敏感，实验组和对照组的条带出现了明显差异。用GAPDH作内参不可行。但更尴尬的事情还不止于此。根据以往的文献报道，其他几个常用内参要么有文献明确报导过它对高温不稳定，要么没有文献证明它究竟是否可以用于高温模型。最后，我就去问了一位老师，那位老师说，他做高温模型比较多，其实也发现GAPDH对高温不太稳定这个现象，但是目前几个常用内参中，只有GAPDH还凑合。他最后给出的解决方案是直接选择总蛋白作参照。我是第一次听说总蛋白可以拿来做参照，觉得非常新鲜，后来又查询了一些资料，发现真的可以这么操作，原来总蛋白也是可以做内参的，我的认知又被改写了，今后又多了一条思路。所以，做实验的时候，如果遇到一些意外，这并不一定就是坏事，那很可能是一个值得你去学习的地方。