流式细胞分析仪器与技术

（一）概念

1. 流式细胞术 流式细胞术是一种对处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析和分选的技术。
2. 双参数分析 双参数分析指的是结合检测对象两个参数进行分析。常以流式散点图和等高图表示。使用的参数可以是前向角散射光信号、侧向角散射光信号和各种不同荧光素标记产生的荧光信号两两间的组合。
3. 荧光灵敏度 荧光灵敏度是衡量流式细胞仪检测荧光信号的重要指标，指的是仪器能检测到单个微球上标有FTC或PE等荧光分子的最小值，常用等量可溶性荧光分子来表示
4. 同型对照 在流式测定中为消除荧光素的影响设置的阴性对照称为同型对照。如果偶联荧光素的特异性抗体为lg1类抗CD3-PE，那么使用的对照抗体为lgG1类的PE标记的非特异性抗体（lgG1-PE）

（二）分析型流式细胞仪的工作原理

经过特异荧光素染色的单细胞悬液样品，在气体压力的作用下进入流式细胞仪（FCM）的流动室。与此同时鞘流液也由专门的管道进入流动室，两者混合形成层流，自喷嘴口逐一连续射出，被与其垂直的特定波长的激光束照射，细胞表面的荧光素产生特定波长的荧光，同时产生光散射。这些混合的光信号经光电倍增管（PMT）和光电二极管转变为电子信号，经过模数转换器以电子脉冲的形式被计算机系统接收，最后计算机通过相应的软件分析出细胞的生物学特征。

（三）分析型FCM的基本结构

分析型FCM的结构主要由液流系统、光路系统信号检测系统、数据分析及显示系统组成。

（四）分析型FCM的主要性能指标

分析型FCM的主要性能指标包括灵敏度、分辨率、表面标志物检测准确性和重复性、分析速度、荧光线性和仪器稳定性等。只有以上指标达到规定标准FCM才能使用

（五）分析型FCM应用的技术要点

1. 样品制备 关键点是检测标本必须制备为单细胞悬液。
2. 荧光素标记 不同的荧光染料有其特定波长的激发光和发射光。流式分析时可以通过标记不同的荧光素来同时检测多个指标常用于流式检测的荧光素有藻红蛋白和异硫氰酸荧光素等。荧光素标记时进行封闭可有效避免非特异的干扰
3. 对照设置 阴性对照分3类，其中同型对照是最常采用的阴性对照，目的是消除荧光素的影响。需要时设置阳性对照。
4. 仪器操作要点 要定期进行光路和流路的校准和PMT校准。补偿调节、阈值设定和上样速度控制是操作FCM的几个关键点。

（六）xMAP技术的基本原理

把直径为5.6μm的聚苯乙烯微球用两种或三种分类荧光染色，通过调整两种或三种荧光素的比例获得最多100种或500种具有不同特征荧光谱的微球。然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原抗体或核酸探针等捕获分子，作为检测试剂。由于最多可有500种不同类型的微球，所以一份标本最多可以同时定量检测500个项目。检测标本时，先把针对不同检测项目的编码微球混合，再加入待检样本、在悬液中靶分子与微球表面交联的捕获分子发生特异性结合。结合有待测物的微球通过一定的反应与含另一种荧光物质的报告分子结合。最后，微球在检测仪中单个依次通过红绿两束激光，红激光用以判定微球的荧光编码，用于确定检测的项目，而绿激光用以测定微球上报告分子的荧光强度，用于确定待测标本中此项目的含量。

（七）流式细胞术在生物医学研究和临床诊断中的应用

1. 生物医学研究主要包括细胞群比例测定，细胞凋亡检测，细胞周期检测和干细胞分选等方面的应用。
2. 临床诊断主要包括感染性疾病诊断、血液系统疾病诊断肿瘤诊断和疗效判断以及自身免疫性疾病诊断等方面的应用。