实验专栏丨马上要做WB实验，这些常见问题如何应对？

关于蛋白质免疫印迹（Western Blot，即 WB），想必做蛋白实验的小伙伴们都不会陌生，作为免疫学中最常用的一种实验方法，其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析条带大小和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

但是或许原理大家都懂，实验做起来却并不容易，每当我们准备好样本，满心以为自己可以做出这样的实验结果时却总是不如人意。

那么为了避免出现以上问题，下面就由中洪君给大家梳理一下 WB 中常见的问题以及解决方法。

1、目的蛋白信号弱

可能原因 解决方案样本上样量不足或者蛋白浓度过低加大上样量或者浓缩样品抗体浓度偏低增加抗体浓度或者延长孵育时间显色剂底物浓度不足增加显色剂用量显色剂失效更换显色剂，显色剂A和B不可交叉混用显色或曝光时间不足延长显色或曝光时间

2、转膜效率低

可能原因解决方案转膜缓冲液PH值与目的蛋白等电点相近提高转膜缓冲液PH值凝胶与转印膜之间存在气泡转膜时应排除所有气泡凝胶与转印膜两侧滤纸大面积接触滤纸、转印膜裁剪与凝胶大小相等

转印膜种类选择不当使用质量可靠的PVDF或者NC膜电压或者电流过小调高电压或者电流转印时间过短或者过长根据蛋白大小和装置类别选择合适的转印时间湿转过程中温度过高使用预冷的转膜液，湿转置于冰水中

3、显色或曝光后无条带

可能原因解决方案选用一抗、二抗或者显色液不合适更换一抗、二抗或者显色方法目的蛋白低于检测下线加大上样量或者浓缩样品抗体效价过低增加抗体浓度

抗体孵育时间不足增加孵育时间抗体过度洗涤减少洗涤时间和次数加入底物反应与曝光间隔时间过长减少间隔时间

4、Western blot背景高且不均匀

可能原因解决方案封闭物用量不足提高封闭浓度，使用适当体积保证孵育时完全覆盖转印膜封闭物使用不当检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶封闭封闭的时间不够延长封闭时间抗体非特异性结合减少抗体的浓度和孵育时间抗体浓度过高或洗涤不彻底降低抗体浓度，增加洗涤时间和次数化学显色底物过多减少显色底物用量

5、非特异性条带

原因：一抗非特异性与蛋白结合

解决办法：更换一抗

经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然这种情况下有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。

6、条带拖尾

原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长

解决办法：根据情况调整蛋白量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。

经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减料，建议5min*5次。

7、某个条带变形

原因：SDS-PAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒

解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。

经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有杂质。

8、条带呈哑铃状

原因：配置胶有问题

解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用

经验：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。

9、western显色的方法主要有以下几种：

1）放射自显影

2）底物化学发光ECL

3）底物荧光ECF

4）底物DAB呈色

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

10、以下方法可增强发光强度

增强敏感性，若目的条带未出现，或很淡，可试用以下方法增强发光强度：

1）用清水漂洗膜数分钟，重加发光液进行曝光，可延长曝光时间。

2）将膜在PBST或TTBS中洗涤30min或更长，期间至少换2次液。

3）封闭40~60min一抗杂交，室温1h。

4）37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。

5）PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

6）二抗杂交，37℃ 1h。

7）PBST或TTBS洗膜20min，期间换2次液。

8）发光鉴定。

9）若条带仍未出现或很淡，可以再用PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

10）三抗杂交，室温1h。37℃ 1h 会更强，但可能增加非特异条带。三抗即抗二抗的二抗，比如二抗用羊抗兔，此时三抗可以选择兔抗羊或鼠抗羊等。

11）PBST或TTBS洗涤膜20min，期间换2次液。

12）发光鉴定。一抗溶液中加入0.2% 叠氮钠后可4℃存放至少2周（一个月我也用过，没问题，再长时间还没试）

中洪Western Blot实验服务

一、实验流程

1. 蛋白质抽提；

2. 蛋白质定量；

3. 变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳（SDS-PAGE）；

4. 蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜；

5. 膜的封闭和抗体孵育；

6. 结果检测。

二、实验交付

1、客户提供：

组织或细胞和一抗，或者一抗代购。

2、公司提供：

（1）Western Blot曝光后图片；

（2）完成的数据分析图表；

（3）完整的实验报告。

3、实验周期：2周

三、实验结果示例