4分+基因家族在泛癌中的研究套路

大家好，这次给大家分享的文献是The pan-cancer landscape of netrin family reveals potential oncogenic biomarkers，2020年3月发表在Sci Rep杂志上，影响因子4.011。文章利用公共数据资源TCGA，整合多种癌型对netrin蛋白家族进行多组学的分析，是一篇泛癌分析的范文！

题目：The pan-cancer landscape of netrin family reveals potential oncogenic biomarkers

netrin家族的泛癌图谱揭示了潜在的致癌生物标志物。

研究流程图

摘要

背景：最近的癌症研究发现，netrin蛋白家族在某些癌症的发生发展中起着重要作用。然而，这些蛋白的许多变体在癌症中的功能仍不完全清楚。

方法：在这项工作中，作者使用最全面的数据库，包括超过30种肿瘤类型的10000个样本，来分析netrin家族的6个成员。对netrin基因的遗传变化和表达进行了综合分析，分析了netrin基因的表观遗传和途径关系，以及这些蛋白的表达与药物敏感性的关系。虽然netrin家族在泛癌中的突变率较低，但在netrin基因突变的肿瘤患者中，子宫体子宫内膜癌患者最多，占13.6%（397例中54例）。netrin家族成员NTNG1的最高突变率为38%（397个家族中的152个）。

结论：Netrin蛋白可能参与内分泌相关肿瘤和性激素靶向器官肿瘤的发生发展。此外，NTNG1和NTNG2参与多种癌症的研究，显示了它们作为新的肿瘤标志物和治疗靶点的潜力。这一分析为该蛋白家族提供了广阔的分子前景，并为癌症的治疗提出了一些新的方向。

结果

Netrin家族在泛癌中的突变及融合基因分析

在TCGA中的33种癌症中发现了netrins的突变（图1a）。在癌症水平上，与子宫体子宫内膜癌（UCEC）相关的netrins突变数最高（54），其次是结肠腺癌（COAD）（49）、皮肤黑色素瘤（SKCM）（47）、胃腺癌（STAD）（42）、肺腺癌（LUAD）（38）和肺鳞状细胞癌（LUSC）（36）。Netrin家族成员在上述6种肿瘤中的总突变率分别为10.19%、12.28%、10.06%、9.61%、6.70%和7.32%。在肾乳头状细胞癌（KIRP）和甲状腺癌（THCA）中，仅发现两个和一个netrin基因突变。分析表明，不同的基因含有突变热点（图1b）。CCLE的NTN家族成员的突变分布表明，大多数突变集中在层粘连蛋白N结构域（图1c），TCGA中也发现了大多数的多重突变。

经遗传祖先群和非同义突变筛查，62例患者有完整的NTN1基因突变信息（64个突变），34例患者有完整的NTN3基因突变信息（37个突变），107例患者有完整的NTN4基因突变信息（120个突变）。此外，数据包括33例NTN5突变的患者，152例NTNG1突变的患者和161例NTNG1突变的患者，以及91例NTN5突变的患者（图2a）。通过比较数据，作者发现在单个患者中，多达四个netrin家族成员包含四个NTN1和NTNG2突变的患者、三个UCEC患者和一个STAD患者的突变。在netrin基因至少有5个突变的癌症研究中（图2b），UCEC患者是netrin家族突变相关的两个最高癌症之一，NTNG1突变最多。SKCM的NTN4突变最多。从种族分布来看（图2c），四个遗传祖先群中癌症突变最多的是UCEC，STAD的netrin家族突变主要分布在EAA和NA。COAD中大部分netrin突变发生在EA和AA。对突变的进一步分析（图2d，e）显示，除NTN5外，netrins的大多数突变位于层粘连蛋白N-末端结构域。在NTN1、NTN3、NTN4和NTN5的层粘连蛋白EGF结构域中，大多数突变位于层粘连蛋白EGF样2结构域。

在肿瘤发生过程中，基因组水平裂解和呼吸产生的融合基因往往是肿瘤诊断治疗的靶点。使用TCGA融合基因数据库（图3a）从33个TCGA癌症中高度自信地检测到NTN家族的融合转录本。在肉瘤（SARC）中检测到LETMD1（人宫颈癌癌基因）与NTN4融合（图3b）。NTN4和LETMD1与肌组织学类型有关（图4c）。

图1

图2

图3

netrins在泛癌组织中的表达及临床分析

通过基因表达谱交互分析（GEPIA）30（图4a）对33例TCGA癌进行了差异表达分析。Kaplan-Meier和GEPIA（图4b）分析了33种TCGA肿瘤的生存曲线，发现netrins对CHOL、DLBC、KICH、UCS、LAML和TGCT的生存无影响。在泛肾（KIRP和KIRC），几乎所有netrin家族成员都影响生存。通过LinkedOmics对32种TCGA癌症中netrin家族的所有成员进行了全面的表达临床分析（图4c）。在泛肾（KIRP和KIRC）中，NTNG1与KIRP和KIRC的病理T期相关，NTN4与KIRP的病理T期、病理N期和病理M期相关。NTN家族成员在正常（NP）、冠心病（CHD）、结直肠癌（CRC）、肝细胞癌（HCC）、胰腺癌（PAAD）和乳腺癌（BC）中的表达数据来自exoRBase（图4d）。NTN1、NTN3、NTN5和NTNG1在血液中低丰度表达。相比之下，NTN4和NTNG2在血液中的表达相对较高。NTN4的表达在PAAD血中高，NTNG2的表达较低。对最佳生存曲线（图4e）的分析显示，在PAAD中高表达NTN4的生存率较差，而低表达NTNG2的生存率较差。NTN4和NTNG2在PAAD组织及其血液中的表达趋势一致。对美国国家癌症研究所（NCI-60）33的60个细胞系的数据进行检测（图4g），发现NTN1蛋白存在于乳腺癌、黑色素瘤和卵巢癌的细胞外小泡中。

图4

netrins在泛癌中的甲基化及临床分析

使用GSCALite分析了TCGA 33癌中NTN家族成员及其下游基因的甲基化（图5a-c）。作者发现乳腺癌中NTN3，NTN4，NTN5，NTNG1和下游基因UNC5C，UNC5D，DCC和TP53的甲基化上调。netrins和下游基因的类似共甲基化模式也存在于癌症，如UCEC、LUAD、ESCA、HNSC和COAD（图5a）。此外，netrin家族成员的表达主要与甲基化呈负相关，只有少量的正相关（图5b）。甲基化与生存率的关系（图5c）显示，肾乳头状细胞癌（KIRP）中NTN1低甲基化的生存率较低，肾透明细胞癌（KIRC）中NTNG1的生存率较低，这与KIRP中NTN1和KIRC中NTNG1高表达与生存率较低的相关性一致。这可能表明NTN1和NTNG1在泛肾癌中的致癌机制与启动子甲基化有关。使用LinkedOmics对32例TCGA癌症中NTN家族的所有成员进行了全面的甲基化临床分析（图5d）。NTN1、NTN3、NTN4、NTN5和NTNG1甲基化与放射治疗和LGG总生存率相关。NTNG2甲基化与GBM的放射治疗有关。

图5

netrin家族基因在泛癌中的转录及表观遗传学分析

从ChIPBase v2.0下载了netrin家族成员和转录因子的共表达数据，这些转录因子的结合位点位于启动子上游或下游1kb内，以及TCGA 32种癌症中的染色质重塑因子（20个NTN1修饰因子，25个NTN3修饰因子，19个NTN4修饰因子，3个NTN5修饰因子，18个NTNG1修改器和24个NTNG2修改器（图6）。雄激素受体（AR）是一种与前列腺癌发生有关的转录因子。作者发现在前列腺癌中，NTN3的转录受到EZH2和AR的正调控（图6b），这表明NTN3可能在前列腺癌中起致癌作用。EZH2可作为鉴别胸腺鳞状细胞癌和B3型胸腺瘤43的新的诊断指标。胸腺中NTN1的转录受到EZH2的负调控（图6a），提示胸腺瘤中NTN1的低表达与胸腺的发生发展有关。转录因子ETS1的上调与乳腺癌的侵袭有关。乳腺癌中NTNG2的转录受ETS1的正调控（图6f），提示NTNG2可能与乳腺癌的发生发展有关。使用miRWalk，预测了总共1238个mirna，它们可能以netrin转录物的3′UTR为目标（图7a）。统计分析表明，55个mirna与netrin家族的至少三个成员相关（图7b）。将这些序列与STARBASE v3.0中的数据进行比较，两个数据库中均包含42个mirna。我们进一步用FDR<0.05和负相关作为筛选标准，观察mirna和netrin家族成员在32种TCGA肿瘤中的表达相关性（图7c）。发现胸腺癌中有一半的mirna对NTN1有很强的抑制作用。

图6

图7

泛癌组织中netrins的pancan-eQtL分析

通过PancanQTL在TCGA 33癌中寻找与netrin家族成员相关的Cis-eQTLs（基因转录起始位点1 Mb内的snp）。在癌症样本中鉴定的大多数eqtl是癌症特异性的，因此可以在与GWAS（全基因组关联研究）数据相关（图8a）后确定癌症和复杂疾病中netrin eqtl之间的关系。作者确定netrin家族成员有更多影响THCA基因表达的eqtl，并且大多数与GWAS相关（图8b）。7个与NTN1相关的eQTL（端粒长度）和1个eQTL（帕金森病）对转录因子结合有影响。3个eqtl（rs9894790、rs9901637和rs11650713）被发现影响MYC、TCF12、EBF1、EGR1和NR2F2的结合。此外，NTN1在甲状腺癌中的高表达与生存率差相关。因此，这些eqtl可能改变这些转录因子的活性，以普遍促进NTN1转录，从而导致甲状腺癌。

图8

netrin家族在泛癌中的药物及途径分析

通过GSCALite分析了netrin家族成员在癌症途径中的作用（图9a，b）。在netrin家族中，NTN4对细胞凋亡、细胞周期和DNA损伤反应的抑制作用最强，对细胞周期具有完全的抑制作用。NTNG2对EMT的激活作用最强，对ER和RTK的抑制作用最强。通过癌症药物基因组学研究数据库PharmacoDB下载了与netrins相关的癌症药物列表，选择p<0.05，标准化系数>0.1，以及五种最敏感的癌症药物（图9c）。高表达的NTN1和NTN3均对比卡鲁胺敏感。作者推测NTN1和NTN3可能是激素敏感型前列腺癌的潜在靶点。

图9