小金の实验进阶——慢病毒转染实录

各位站友大家好啊，五一长假过后又到了开始学习新知识的大好时间，今天小金来跟大家分享一下如何使用慢病毒转染牙髓细胞。（有兴趣的站友可以猜一下上图用显微镜拍出来的彩色条带是什么，答案文末揭晓）

首先我们要知道一下使用慢病毒的注意事项：

1、在生物安全柜中使用慢病毒（慢病毒（lentivirus）载体是以HIV-1为基础发展起来的基因治疗载体。它可以将外源基因或外缘shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的基因序列的效果。慢病毒具有感染能力但是不具备复制能力，因此是不会传染人的，但仍有潜在的生物学危险。）

2、清洗与消毒

• 任何接触过病毒的材料、试剂，样品，应经过消毒处理，可以采用1%的SDS溶液或84消毒液（1:20）浸泡半小时以上，或121℃，灭菌20~30min。
• 实验完成后，请用医用消毒液清洗双手。切勿直接接触病毒，如意外接触，请及时用清水冲洗，并适当对皮肤进行消毒。

3、储存

• 慢病毒应于-80℃条件下长期保存，临时使用可以置于4℃（一周内使用，且存放时间越长，滴度下降越明显。）不要在-20℃条件下长期保存慢病毒，避免反复冻融，病毒的滴度会下降。

4、慢病毒的稀释与使用

• 可加用PBS（冰）或培养基（冰），适当稀释（10倍）
• 在生物安全柜中使用病毒时应该放置于冰上或冰盒中缓慢溶解
• MOI越高，转染效率越高，同时对细胞毒性越大
• 慢病毒表达时间较慢，大部分细胞在慢病毒感染72~96h，荧光表达达到峰值

5、polybrene是一种阳离子聚合物，可以中和电荷以促进病毒外壳与细胞膜之间的结合。通常范围在2~10ug/ml。某些原代细胞如神经元等不适合使用polybrene。

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接下来我们再来学习两个非常重要的名词解释：

病毒的滴度（titer）：病毒的滴度是指单位体积病毒液具有活性的病毒单位数量，是衡量病毒质量的核心标准。慢病毒的滴度一般表示为TU/ml，TU=transfection unit（转染单位）。

【TU/ml：是常用的慢病毒滴度单位，Transducing Units/ml的缩写，中文为转导单位，指每ml中含有的具有生物活性的病毒颗粒数，表示可以感染并进入到靶细胞中的病毒基因组数；

慢病毒1号：4.09E8TU/ml=4.09×10^8TU/ml

干扰对照慢病毒：（不含Cav1.2，但含有GFP，含有抗嘌呤霉素基因）2.40×10^9TU/ml】

感染复数（MOI，multiplicity of infection）：为感染时病毒和细胞数量的比值，即平均每个细胞感染的病毒活性单位数（慢病毒单位为TU/cell）。通常在实验中将某种细胞感染达到80%的MOI定义为这种细胞的最适MOI。影响MOI的因素包含：细胞数目，目的基因的大小与性质，细胞的种类等。

【感染复数的大小通常需要你自己在96孔板中接种细胞，设置不同MOI实验组，摸出一个进行后续试验的最适MOI。】

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实验步骤：

第一天：

6孔板中接种2×10^4个/孔细胞

第二天：细胞汇合到30%~40%左右开始加病毒

按照MOI算好每孔需要加的病毒量

每孔加的病毒量（ul）=MOI×感染时的细胞数/滴度（TU/ml）×1000

（注意：一般第二天的细胞数按照倍增来算，生长较慢或不增值的细胞可适当调整）

如：病毒滴度1×10^8TU/ml，第一天接种细胞数1×10^4，那么MOI为10的组中病毒量=10×2×1×10^4/（1×10^8）×1000=2ul，依次类推。

简要步骤：

1、将polybrene，病毒1号，空病毒提前拿出，放至4℃冰箱中，照台子（放一个冰盒进去），预热培养基

2、polybrene，病毒1号，空病毒离心，使病毒液聚集管底

3、病毒1号，空病毒+PBS（冰）稀释10倍（10ul病毒+90ulPBS，因为是高浓度的病毒，如果不稀释的话所加的病毒量很小，可能不在移液枪的范围内，所以为了方便通常会稀释一下）

4、将polybrene和DMEM配好，加入细胞培养板中

5、再加入病毒，轻晃匀

第三天：换液

感染后12~16h，更换新鲜培养基，继续培养

第五天：观察，拍照，加抗生素筛选已被感染的细胞

• 感染后72h在荧光显微镜下观察，并拍照，若荧光弱，可到96h后再观察，若96h后仍无荧光，则感染实验失败。

    （如果荧光效果差，则重新再转染一次慢病毒）

• 加抗生素【目的是筛选转染成功的细胞，通常病毒携带的目的基因中会加入抗嘌呤霉素的抗性基因，加入嘌呤霉素后转染成功的细胞不会死去，未转染成功的细胞则会死去】（嘌呤霉素，培养液中浓度一般为1~10ug/ml，这个也要在前期96孔板预实验中摸浓度）

记住不要在对照组中加入嘌呤霉素！！！

第7天/8天：换液，观察筛选效率（QPCR，western blot）

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第一张背景图的彩色条带是玻璃片儿的边缘，因为在荧光纤维镜下拍照的时候用的是细胞爬片，意外的发现拍这个玻璃片儿边缘会出现意想不到的“霓虹灯图像”，非常的美，感兴趣是站友下次也可以看看镜下的玻璃片边缘是什么样的。