细胞凋亡通路系列之三：Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路

细胞凋亡通路系列之三：Bcl-2/Bax/Caspase-3信号通路

一、Bcl-2家族

1、分类

Bcl-2（B-cell lymphoma/leukemia 2，B细胞淋巴瘤/白血病-2）家族蛋白的一个显著特征是具有 Bcl-2 同源结构域（Bcl-2 homology domain，BH）。根据其功能和结构的不同可将 Bcl-2 家族蛋白分为三类。

（1）第一类是 Bcl-2 亚家族，属于抗凋亡成员，包括 Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-l、Bfl-1/A1、Bcl-G 等。它们一般均同时含有 BH1-BH4 四个同源结构域和一个 C 端疏水尾状结构，即跨膜（TM）结构域，这使得它们定位于线粒体外膜，偶尔也定位于内质网表面，其蛋白的跨膜立体结构朝向细胞质。其中 BH4 是抗凋亡蛋白所特有的结构域，决定着抑制细胞凋亡功能的存在。

（2）第二类是 Bax 亚家族，具有促凋亡活性，包括 Bax、Bak 等。其结构中一般都含有 BH1-BH3 三个同源结构域和一个 TM 结构域，缺少 BH4 同源结构域。

（3）第三类是促细胞凋亡蛋白中的特殊成员 BH3 亚家族，包括 Bad、Bid、Bim、Bik、Puma、Noxa 等。此亚家族最显著的特点是仅含有一个 BH3 结构域，BH3 结构域被认为是细胞凋亡所必需的致死性结构域，起促凋亡活性的发挥至关重要。

2、BH3结构域

虽然这些成员都被归为 Bcl-2 家族，但各成员在共有的 BH3 结构域的氨基酸序列上并没有太多的相似性，一级结构存在较大的差异，但高级结构和功能却基本相仿，即作为一个典型的 α-螺旋结构发挥促凋亡作用，因此把它们归为 Bcl-2 家族，仅是由于分类方便，并不是如人们所想的那样提示着某种进化上的关系。

三维结构研究表明，BH3 结构域通常是促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白形成二聚体所必须的，并且一般是抗凋亡蛋白（Bcl-2 亚家族）的 BH1、BH2、BH3 结构域形成一各伸长的疏水口袋，而促凋亡蛋白的 BH3 结构域作为一个两性螺旋结构与其结合。在此过程中，抗凋亡蛋白的 BH4 结构域可以稳定这种结合作用。这种结合作用是的 BH3 结构域被覆盖，从而不能发挥有效的促凋亡活性。

3、二聚体

Bax 蛋白中的 BH1、BH2 两个同源结构域可形成一疏水凹槽，与其 N 端的 α-螺旋（BH3螺旋片段）通过静电和疏水作用结合形成 Bax/Bax 同源二聚体。而易位至线粒体外膜上的促凋亡蛋白 Bax 表面暴露的 BH3 螺旋可与抗凋亡的 Bcl-2 蛋白表面的疏水凹槽结合，形成 Bcl-2/Bax 异源二聚体。

特定的蛋白二聚体对细胞凋亡进程产生不同的影响，这是 Bcl-2 蛋白家族在细胞死亡信号转导调控过程中所特有的重要特征，是凋亡“主开关”作用发挥的重要结构域。

• 研究发现，通常情况下 Bcl-2 和 Bax 两种蛋白的表达量相对稳定。
• 而当 Bax 在细胞内超表达时，Bax/Bax 同源二聚体的数量明显增多，细胞对死亡信号的反应性增强，启动凋亡。
• 而当 Bcl-2 高表达时，则 Bax/Bax 二聚体大量解离，生成更为稳定的 Bcl-2/Bax 异源二聚体，对抗其诱导凋亡的作用，使细胞存活期延长。

4、相互作用

所有的 Bcl-2 亚家族都可以隔离 Bax，但只有 Bcl-xl、Mcl-1 可与 Bak 结合[4]。

Bcl-2 亚家族的抗凋亡作用可以被 BH3 亚家族成员拮抗，如 Noxa、Bad、Bim 通过置换将它们的 α-螺旋 BH3 结构域插入 Bcl-2 亚家族蛋白的疏水凹槽中， 导致被隔离的 Bax 和 Bak 释放和间接活化。这样的相互作用具有选择性[4]。

• Noxa 只与 Mcl-1、A1 结合；
• Bad 只与 Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w 结合；
• Bim、tBid、Puma 均可与 Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w、Mcl-1、A1 结合。

此外，Bim、tBid、Puma 可直接结合并活化 Bax、Bak[4]。

二、Bcl-2/Bax调节凋亡

1、促凋亡成员移位

Bcl-2 家族成员的亚细胞定位于死亡信号直接相关。抗凋亡蛋白成员（Bcl-2亚家族）最初是在线粒体、内质网或核膜中作为整合膜蛋白而被发现的。在死亡信号不存在时，一些促凋亡蛋白大多定位于胞质或者细胞骨架，伴随着死亡信号的刺激，这些促凋亡成员发生了构象的改变，并允许它们整合到膜上，尤其是线粒体外膜。在此过程中，Bcl-2 家族成员中的促凋亡成员本身受到一系列的调节，最终导致线粒体结构与功能变化，如线粒体膜电位（MMP，见帖：MMP（线粒体膜电位））的降低、线粒体通透转化孔（mPTP，mPTP（线粒体通透性转换孔））的开放以及细胞色素C（Cyt-c）的释放，激活 Caspase 介导细胞死亡。

2、Bcl-2

抗凋亡基因代表成员 Bcl-2 是第一个被确认的能对抗细胞凋亡的基因，可编码 Bcl-2α（26 kD）和 Bcl-2β（22 kD）两种蛋白，其中 Bcl-2α 是抑制凋亡作用发挥的主要蛋白，为线粒体膜的整合蛋白。在其肽链的 C 末端具有疏水性跨膜（TM）结构域，可通过该疏水区锚定于线粒体外膜、外核膜及部分内质网膜表面，是阻止凋亡早期征象发生的重要区域。

Bcl-2 可通过线粒体途径、内质网途径抗细胞凋亡。

（1）线粒体途径

定位于线粒体外膜上的 Bcl-2 至少在三个水平上发挥凋亡抑制作用：

• ①通过抑制谷胱甘肽（GSH）的外泄、降低/对抗线粒体巯基的氧化还原状态以控制其膜电位（MMP）从而抑制细胞凋亡的发生；
• ②通过介导线粒体外膜通透转运孔（mPTP）孔道复合体的开放，抑制细胞色素C（Cyt-c）和凋亡诱导因子（apoptosis-inducing factor，AIF）等促凋亡蛋白的释放阻止凋亡的进程；
• ③通过与胱冬肽酶（Caspases）的间接作用，将 Apaf-1 定位至线粒体膜，通过对其结构的调控阻断凋亡蛋白酶的激活，阻止 Cyt-c 作用的发挥，使细胞免于死亡。

（2）内质网途径

定位于内质网膜上的 Bcl-2 抗细胞凋亡作用的发挥主要与胞内的 Ca2+ 浓度有关。在凋亡的早期，内质网中的 Ca2+ 持续释放，导致胞质中的 Ca2+ 浓度持续增高，可充当凋亡的启动信号引发细胞凋亡。Bcl-2 高表达可抑制 Ca2+ 从内质网向胞质中的跨膜流动，使 Ca2+ 依赖性核酸内切酶活性降低，胞质中 Ca2+ 浓度处于稳定水平，从而抑制细胞凋亡。

3、Bax

促凋亡基因代表成员 Bax，能够编码 α、β、γ、δ、ε、σ 共 6 种 Bax 蛋白亚型。Bax 基因编码的具有生物学活性的 Baxα（21 kD），是 Bax 基因在细胞中发挥促凋亡作用的主要表达形式。

Bax 蛋白多以非活性单体形式分布于胞质中，只有在接收到凋亡信号刺激被激活后，发生分子构象改变，移位并插入线粒体外膜后形成 Bax/Bax 同源二聚体蛋白通道，破坏线粒体膜的完整性，促进细胞色素c（Cyt-c）的释放，导致 Caspase 的激活。Bax 同时与 Bcl-2 等抑制凋亡的蛋白对抗，阻止其抗凋亡作用的发挥。

三、Caspase 级联反应

细胞凋亡的发生和发展可以概括为凋亡诱导、调控执行和效应三个阶段，现已证明至少有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径三条通路参与凋亡的发生。其中线粒体依赖途径是主要的传导途径，JNK 通路（见帖：JNK信号通路）是主要信号转导通路，Cyt-c 是线粒体电子电子传递链上的一个重要组成部分，其从线粒体释放是凋亡启动的关键步骤。

Caspase-3 作为 Caspase 级联反应下游最关键的凋亡执行者，其激活在很大程度上依赖于Cyt-c 的释放，而 Bcl-2 家族中的 Bcl-2、Bax 基因是目前已知的细胞凋亡中最重要的调控基因，可通过线粒体途径介导 Cyt-c 等物质释放。

Bcl-2、Bax 不但可作为 Caspase-3 的上游调控机制，参与对 Caspase-3 活性的调节，还可作为 Caspase-3 的直接底物作用于 Caspase-3 的下游，二者在细胞凋亡传导过程中既相互联系又相互制约。

2、上游调控机制

Bcl-2、Bax 蛋白位于线粒体上游，是线粒体膜的通透性改变的重要调控因素，其过度表达能控制 Cyt-c 的释放和下游 Caspase-3 蛋白酶的活化，介导细胞的存活或死亡。

（1）Bax 促凋亡机制

Bax 在死亡信号刺激下可转位至线粒体膜上，形成同源二聚体或多聚体，并在线粒体膜上形成通透性 PT 孔道，破坏膜内离子及蛋白浓度差，释放出 Cyt-c 等促凋亡因子。在 dATP 存在下，Cyt-c 通过半胱氨酸蛋白酶作用域与 Apaf-1 结合形成凋亡体，并招募 Pro-caspase-9 在其上寡聚，进而激活 Caspase-3，启动 Caspase 级联反应（见帖：Caspase级联反应）。

（2）Bcl-2 抗凋亡机制

超表达的 Bcl-2 蛋白一方面可与 Bax 形成异源二聚体，抑制 Bax 的转位及二聚体化，关闭 PT 孔道，通过阻断 Cyt-c 的释放，抑制下游 Caspase-3 的激活，而有效地抑制细胞凋亡的发生。

另一方面，Bcl-2 还能与 Apaf-1 结合并抑制其功能，阻止 Pro-caspase-9 活化实现抗凋亡的效应。

此外，有研究发现 Bcl-2 的过度表达可引起细胞核谷胱甘肽（GSH）积聚，导致核内氧化还原平衡的改变，阻止胞内 Ca2+ 流动，抑制线粒体膜释放 Cyt-c，从而抑制 Caspase-3 的活化，阻断凋亡进程。

3、下游调控机制

Bcl-2 可作为 Caspase-3 的直接作用底物，Bcl-2 蛋白的 N 端可变环区可被 Caspase-3 在 Asp34 处剪切，裂解为具有类 Bax 促凋亡活性功能的片段，加速凋亡进程。这一步骤被证明是凋亡信号转导最关键限速步骤之一。 Caspase-3 是 Bcl-2 的生理性酶解蛋白酶，可构成阳性凋亡反馈通路。

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参考文献

[1]柳向军,张令强,刘小林,等.细胞凋亡中的Bcl-2家族蛋白及其BH3结构域的功能研究[J].生物化學與生物物理進展,2006,33(3):221-225.

[2]董雅洁,高维娟.bcl-2、bax、caspase-3在细胞凋亡中的作用及其关系[J].中国老年学杂志,2012,032(021):4828-4830.

[3]BH1-4 蛋白结构域 - CST

[4]张岳,张伊佳,李学军.BH3类似物促细胞凋亡机制及临床研究进展[J].中国药理学与毒理学杂志,2017,31(01):1-11.