组织块法&酶消化法——牙髓干细胞分离培养

组织块法&酶消化法——牙髓干细胞分离培养

        今天分享一下使用组织块法&酶消化法分离培养牙髓干细胞的实验技术以及所用到的相关试剂材料。

目前文献中使用最多的方法是2000年Gronthos使用的胶原酶+中性蛋白酶法。然而受制于课题组经费+钱要用在刀刃上，逐渐摸索出了一套省钱的流程来获得原代牙髓干细胞。下面我将分组介绍不同的方法以及各自的优缺点。

一、组织块法

顾名思义就是不加任何酶，直接利用组织块让细胞慢慢的爬出，慢慢的扩增。

核心要点：疯狂剪碎组织！

优点：省钱啊啊啊啊啊！！！！不用酶啊啊啊啊！！！

缺点：“慢”就一个字。。。。。（7-10天差不多才能看到有细胞从组织块爬出来）

接下来放实验流程！

器材准备：

1、 离体牙、刮匙、剪刀，镊子，盖玻片，拔髓针，锤子，纱布，15ml离心管，移液枪，*头（1ml）、无菌手套，封口膜；

2、 0.01M（0.01mol/ml）灭菌PBS

3、 DMEM培养液（【双抗1%+FBS20%】，【双抗1%】）

实验步骤：

1、 收集临床拔下的下颌第三磨牙；

2、 用高速手机沿牙颈部磨开牙齿，不要露髓！（但是要磨的尽可能接近髓腔！我一般是磨深度1.5mm左右，宽2mm，如果不敢磨的太深，就一定要磨宽一点，这样带进生物安全柜里好掰开！）

3、 将磨好的牙齿放入DMEM培养液【双抗1%】（不含血清，因为易污染），放入4℃冰箱临时保存；

4、将牙齿带入实验室，无菌镊夹持牙冠与牙根掰断牙齿，暴露髓腔；用小号精细镊或挖匙，轻轻从牙髓腔中分离牙髓组织；

5、将取出的牙髓组织在加入了PBS【双抗1%】中洗涤数遍；

6、将组织加到六孔板中，用眼科剪充分剪碎组织；

7、放入37℃，5% CO2 培养箱中烘干组织块周围的水分20min左右；

8、取出六孔板中，*头沿着壁加入1mlDMEM【双抗1%+FBS20%】，放入37℃，5%CO2，饱和湿度的孵育箱中孵育，3天静止。

9、3天后去加1mlDMEM【双抗1%+FBS20%】；

10、3天后再吸出2ml的培养液和六孔板中未贴壁的组织块，此时换液可以用DMEM【双抗1%+FBS10%】.（10%的FBS已经够了，关键是可以省钱啊啊啊！）

放图！

二、I型胶原酶+组织块法

顾名思义就是加入I型胶原酶，浓度从1mg/ml~4mg/ml都可以，这个范围内的浓度梯度都试过可用，消化时间均为1h。

核心要点：I型胶原酶（你甚至一点也不用剪牙髓，直接把一大块牙髓仍进胶原酶里都可以！！！）

优点：时间快啊！~（3天就能看到有细胞贴壁！）

缺点：money！money！

实验步骤基本与上面相同，只不过从第6步开始稍有变化

6、将组织加到一个15ml离心管上段管壁上，用眼科剪充分剪碎组织；

7、用含有1ml 3mg/ml的I型胶原酶的液体将剪碎的组织冲下去，混匀，放入37℃，5% CO2 培养箱中1h（期间每隔5min拿出离心管手动摇匀离心管中的液体）；

8、将消化的原代组织用1ml的DMEM培养液【双抗1%+FBS10%】中和，终止消化，放入离心机中，1000r/min，5min，离心，去上清，留沉淀；

9、用1ml原代培养液重悬，轻轻吹打，使混匀；

放图！

三、胰酶+组织块法

（强调一下，这个方法听来的但是自己还没有做成功，后期我会在评论区补充实验效果；没成功的原因我还在探寻，但是周边确实有人用这种省钱还快速的方法成功了）

顾名思义就是加入0.125%的胰酶，消化时间1h。

核心要点：0.125%胰酶，1h

优点：时间快！（3-4天细胞贴壁）省钱！（就是传代用的胰酶，把浓度降低一半）

缺点：胰酶嘛，消化起蛋白和细胞来可是毫不手软！（一定要注意下时间！）

实验步骤同胶原酶，只不过是将I型胶原酶换成了胰酶。

最后还想提醒下：细胞实验操作一定要规范，不然霉菌容易找上门！

祝各位站友实验顺利！sci中中中！

（附件含有Gronthos提取DPSCs的文献，如有需要可自行下载）