如何选择肠道菌群的研究手段（一）——多样性16S测序 【肠菌研究方法系列讲解】

        肠道菌群聊了好久了，关于它的研究方法——多样性（16S测序）、宏基因组（Metagenome）、宏转录组（Metatranscriptome）、宏蛋白组（Metaproteomics）、宏代谢组学，这些名词每天都会提到，但具体的细节一直没讲，今天准备逐一做下梳理，让研究肠菌的朋友在方法选择上有所取舍。

          一句话能大概说明白它们的侧重点：多样性（16S测序）研究团队（菌群）有哪些人及各种人的比例；宏基因组是团队能干什么；宏转录组是团队准备干什么；宏蛋白组是团队正在做什么；宏代谢组是团队做了什么。下面我一次慢慢把这些研究手段做一下介绍，不妥之处请及时指出来，相互讨论。

多样性16S测序（真菌18S）

          基因测序这个手段应用很广，16S测序是其中小小的微生物测序这一块，而研究肠道菌群又是16S测序应用的一小块。（测序发展到现在有三代，自2005年开始，以pcr扩增为测序手段是第二代，2008年第三代又叫高通量测序，不需要pcr扩，而是边合成边测序。）

           16SrDNA鉴定是指用利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。16S rDNA是编码原核生物核糖体小亚基rRNA的DNA序列，其含量大(约占细菌RNA含量的80%)，分子大小适中（1.5kb），存在于所有的生物中；在结构与功能上既有高度的保守性，还有可变区（保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区反映物种间的差）。既能体现不同菌属之间的差异，又能利用测序技术较容易地得到其序列，是细菌的系统分类研究中最常用的分子钟，故被细菌学家和分类学家接受。

            另外，18S rDNA是编码真核生物核糖体小亚基rRNA（18S rRNA）的DNA序列，序列中既有保守区又有可变区，保守序列区域反映了生物物种间的亲缘关系，而高变序列区域则能体现物种间的差异。由于18S rDNA在进化速率上比较保守，因此在系统发育研究中较适用于种级以上阶元的分类。内转录间隔区ITS位于核糖体rDNA 18S、5.8S及28S之间，由于不需要加入成熟核糖体，因此在进化过程中能够承受更多的变异，其进化速率为18S rDNA的10倍，属于中度保守的区域，利用它可研究种及种以下的分类阶元。

          从上述知，16S测序的应用主要是：细菌分类及种属快速鉴定、各种属菌的丰度情况。其优点是不需要对细菌进行分离培养，能鉴定到许多不能培养的，未知的新菌种；方法直接便捷且速度快。其缺点是由于种间差异小，16S不能鉴定到种，需要其他手段如（宏蛋白组，宏代谢组）补充；另外基于PCR扩展，需要注意假阳性。

          具体步骤如下： 提RNA-PCR扩增-建库-测序-数据分析

          不难得知：多样性检测属于扩增子测序（扩增子测序是对特定长度的PCR产物或者捕获的片段进行测序,分析序列中的变异）。多样性的数据除了a-多样性、b-多样性分析外，还能对物种进行注释，下图是分析流程：

       另外，关于粪便样品做16S检测的取样方法和要求：无菌污染，200mg，-80℃保存，干冰运输。

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