【原创】流式细胞技术-细胞凋亡

最近看到园子里很多同学问流式凋亡的一些问题，翻了翻热门精品贴也没有相关的内容。于是出一个实验流程，供需要的同学参考。

本流程中将使用到由碧云天生物技术提供的Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒，由安捷伦生物提供的NovoCyte流式细胞仪，以及乳腺癌MDA-MB-231细胞株。

1.第一天早上：

T25培养瓶中细胞长满，铺一个六孔板。铺板时应尽量将细胞铺匀，十字形摇晃后置于生物安全柜中十分钟左右，此时细胞已经沉底，但未贴壁。于倒置镜下观察，若分布不均匀可再次做十字形摇晃。

2.第二天早上：

配药加药，使用无酚红的培养基稀释药品至所需浓度。移液器抵板孔边缘吸去原孔中培养基，实验孔（A3.B3）加入稀释药品，对照孔(A1.A2.B1.B2)加无酚红培养基（沿边缘缓慢加入），在盖子上做如下标记（简单标记即可）：

3.第三天早上：

细胞收集：取六支流式管并对应各孔进行标记，转移各孔培养液至对应流式管中。每孔加入适量无EDTA的胰蛋白酶，置于培养箱中1-2min后拿出于倒置镜下观察，待细胞失去正常形态，变圆，并伴随少量漂起时将流式管中的培养液倒回对应的孔中以终止消化。吹打并收集各孔细胞入对应流式管，注意收集完成后可以将细胞板置于倒置镜下观察是否有成片细胞未被吹下。如果有，加入适量培养基重点照顾一下。

细胞清洗：使用PBS离心洗涤3次以去除残留的胰蛋白酶，胰蛋白酶会消化降解后续加入的探针。

探针孵育：以195μl Annexin V-FITC结合液重悬细胞，单染组 Annexin V、双染组、实验组分别加入5μl Annexin V-FITC，轻轻混匀；单染组PI、双染组、实验组分别加入10μl PI，慢速涡旋混匀。置于抽屉中避光室温孵育20min，每隔3-5min摇晃流式管一次。置于冰上，即可上机检测。注意探针孵育过程中尽量避光，安全柜中操作应关闭光源。

流式检测：参数：FSC\SSC\FITC\PE，停止条件：30000事件\100μl，低速。开始上样。

1、无处理组：FSC-SSC用来圈门，其他三个图加象限门并设置坐标，门位置如下。

2、单染组 Annexin V\单染组 PI：我们看到图2、3中细胞群分别向上扩散，说明了探针孵育效果。

3、双染组：该样品即我们的对照组，我们看到图2、3中细胞群均向上扩散。且凋亡率（图4右两个象限相加）<10％，此时数据是可用的。

4、实验组0.004、0.005：该样品即加药组，图2、3细胞群向上扩散说明探针孵育情况良好，且凋亡率随药物浓度升高而提高。

以上即以231为例的流式细胞技术检测药物介导的癌细胞凋亡情况全流程，欢迎讨论指正。