单抗聚体形成原因与调控策略

利用哺乳动物生产的单克隆抗体都会或多或少会有蛋白聚体的存在，聚体的形成原因多种多样，例如在单抗的制备、运输以及储存的过程中，往往都会伴随其产生。聚体的存在一方面会降低药效，另一方面会引入杂质，降低产品的纯度。因此，控制单抗聚体的含量在药物研发过程中显得十分重要。

聚体形成的原因 

聚体(Aggregate)通常由抗体分子间通过共价键或氢键等分子间作用力形成的聚合物，是由两个或多个蛋白组成的稳定复合物，其形成过程十分复杂，包括：

• 蛋白结构破坏，形成聚合物；蛋白空间构象的改变，形成不可逆的聚合物；
• 两个蛋白结合在一起形成二聚体，在此基础上添加单体，使得聚体变大；
• 单抗的Fab段和Fc段的错误折叠、未折叠及正确折叠均可形成聚体，并且当可溶聚体分裂后便不再溶解；
• 蛋白质中二硫键也是聚体形成的因素，半胱氨酸上未进行结合的自由硫醇基会导致二硫键含量的减少，进而蛋白发生错误折叠；

聚体的调控

在细胞培养过程中可以通过调节培养液的理化环境来控制抗体的聚体水平，如温度，pH以及渗透压等。

• Cromwell等人研究发现降低培养环境的温度可以降低聚体水平；
• 聚体水平还会随着培养液pH和渗透压的升高而降低，增加培养液中氯化钠的含量可以提高渗透压，进而降低聚体水平；
• 此外，一些培养基关键组分，如谷胱甘肽、半胱氨酸、胱氨酸和硫酸铜等氧化还原物质可以减少CHO细胞培养过程中抗体聚体的形成；
• 改变蛋白电荷的分布，如通过突变暴露的氨基酸残基、在抗体末端增加带电多肽；研究指出带负电荷的氨基酸可加强蛋白间的静电排斥作用力，从而能够抑制聚体的形成；
• 蛋氨酸残基氧化对多种蛋白形成聚体的倾向性具有重要的影响，为防止蛋氨酸残基的氧化，冷冻通常是抗体储存及运输中的选择，从而可减少聚体的形成。
• 研究发现，培养周期越短，聚体的含量就越低，因此，当产量达标时，上游可通过减少培养时间来降低聚体含量；
• 对pH和离子强度的高低可影响抗体所带电荷，增加蛋白的静电排斥作用力，从而抑制聚体的形成。

如果细胞培养过程中不能去除高聚体含量，则可通过纯化工艺的优化来可降低聚体的含量：

• 纯化中缓冲液的类型是影响聚体含量的重要因素，在纯化中，Protein A洗脱抗体时使用的酸性缓冲液会导致聚体的形成；研究发现，与柠檬酸盐、甘氨酸及组氨酸相比，此步骤的缓冲液中精氨酸的加入可降低收获液中聚体的含量。
• SEC柱析可根据单体与聚体的大小不同，而将聚体去除，但会牺牲部分回收率；
• 超滤也可用于聚体的去除。
• AEX和CEX降低聚体率的机理主要在于其可将二聚体或多聚体分解成单体，最优条件下的聚体含量可降至0.5%以下。

在进行克隆筛选时，选择不易形成聚体的克隆，是降低聚体最为有效的方法，但在克隆挑选时，理想的克隆通常可遇而不可求，当挑选出容易产出高聚体的克隆时，就需要通过细胞培养及纯化工艺优化来调控。有更多知识请关注微信公众号抗体君