代谢组学常见问题(简略整理三)
16.GC-MS代谢组为什么要进行衍生化?
气相色谱仅适用于沸点低、热稳定性好的小分子物质的分离分析,对沸点高、挥发性低、热稳定性差、极性强甚至极易挥发的物质往往不能直接进样分析。
生物样本中含有大量的羟基、胺基、羧基、巯基等官能团的物质信息,因此采用适当的衍生化处理方法对于样品的分离分析往往起着十分重要的作用。
样品的衍生化方法的益处有:
1将一些不适合色谱分析的物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物,可以扩大气象色谱的测定范围;
2改变同分异构化合物的色谱性能,提高和改善样品的峰形和分离度,克服载体、柱壁对高极性、低挥发样品的吸附。甚至通过特殊的衍生方法,分离手性化合物;
3改善待测物质的热稳定性,以提高检测的灵敏度;
4改善待测物质的质谱行为,有利于鉴定化合物的结构。
17.非模式生物进行生物信息学分析有什么难点,该如何进行?
非模式生物往往生物信息数据量少,不太适合直接进行组学数据统计与分析,一般建议将非模式生物的数据通过同源比对的方式映射到模式生物上,然后再以模式生物的数据进行系统的生物信息学分析。
18.质谱的类型与选择?
色谱与质谱联用实现了从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程,且色谱,质谱的类型较为广泛。
对于质谱,为了实现代谢物的定性与定量两个目的,应该选择不同的仪器进行综合分析。
定性分析:可利用核磁共振质谱,高分辨的质谱与三重四级杆质谱一起进行;
定量分析:利用基于三重四级杆系统的质谱,如QTrap,则更为准确。
常用的高分辨质谱:TOF-MS,Orbitrap-MS;
三重四级杆系统的质谱:主要为QTrap与3Q系统的质谱。
19.如何判断一个GC-MS项目结果的好坏?
(1)样本的代谢物的提取和检测是否得到足够多的峰;
(2)组间分群是否好。
20.什么是广泛靶标?
广泛靶向:广泛靶向代谢组学既有非靶向代谢组学的优点也有靶向代谢组学的优点。这种广泛靶向的是不需要标准品的,这项技术是在前期已经建立了公共数据库以外的更多的代谢物,他的数据库更加完善,可以检测到更多。
并且这个技术使用的是三重四级杆,这个是使用在靶向代谢组学上的技术,所以说它具有靶向代谢组的优点。
高灵敏度: 通过离子井进行富集 可以检测到很多低丰度的次生代谢物,而非靶技术无法检测到低丰度物质;
定性准确:相比非靶技术,广靶利用分子量的同时利用二级谱进行物质定性;
数据库全:每个物种都可以自建数据库,建立属于该物种特有的代谢库。
21.代谢组学如何定性的,用的什么数据库?
LC-MS 定性是根据检测到的离子质量数计算加荷模式,比对数据库中的物质的质量数。
GC-MS定性低根据检测到物质定性离子的谱图数据和数据库中物质的谱图进行比对。
目前代谢组学的数据库是不区分物种的,LC-MS 常用的数据库是Metlin、HMDB以及部分自建库。GC-MS 常用的数据库是Fiehn、NIST以及部分自建库。对于脂质组学项目我们除了使用常用的lipid maps之外, 还用了Q-Exactive 自带的lipid search 数据库,该数据库中有150万种谱峰信息,使定性结果更全面、更准确。
22.ChromaTOF软件能否用来对其他类型仪器所得数据进行分析?进行解卷积确定代谢物峰的依据是什么?解卷积是仅对多重峰进行处理,还是将原始数据导入软件后的流程化处理?
所谓解卷积指对软件能将重叠的质谱图分开为“单一组分”的干净质谱图,以便更准确地定性和定量。ChromaTOF软件的优点是可以将去噪、解卷积、定性以及峰对齐一起快速地流程化完成,对GC-MS的数据来说,是最方便的处理软件,其它的软件,应该能完成其中的一两步。单一色谱峰无需进行解卷积。
23.丰度是以峰面积数据,单位什么?丰度较低的怎么确定是不是背景?
丰度就是代谢物的质谱响应强度,没有单位。在用软件对原始数据进行前处理时(包括去噪音、解卷积等)设置信号与噪音的比值为10作为搜库的阈值,所以不会是背景噪音。
24.代谢物的鉴定结果50%的相似度一定不可靠吗?
50%的相似度的定性结果未必不正确,而70%的相似度结果未必就正确,因为GC-MS分析中,总会有很多共流出的峰或低响应强度的峰,这些峰的定性时软件给出的相似度就会偏低,但它的定性结果未必就不准确,这个相似度讲的只是一种可能性,为了让研究者得到更多可供选择的差异代谢物,以防我们筛选标准过严而漏掉一些研究者感兴趣的差异代谢物,我们一般会将50%以上的结果都列上,这样研究者根据自己的实际情况取舍。
25.相应Type对应的参数(R2X, R2Y, Q2, R2, Q2)的值在哪个范围最好?OPLS-DA为什么会有两个Q2?另外cum表示什么?
PCA分析中R2X >0.4为好;PLS-DA和OPLS-DA分析中,R2X这个参数不重要了,主要是R2Y和Q2,这两个值>0.5 为好,越接近1越好。OPLS-DA中Q2(cum),是指建模后模型的预测能力,以大于0.5为宜,越接近1越好,cum表示累积的意思。另外一个Q2是进行模型验证,以防止随机拟合或过拟合的一个评价参数。
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 2333