最近在做Nrf2信号通路，跑western结果很不好，科研小白求助。

    大家好，有些实验上的问题想请教一下各位前辈，我最近在做Nrf2通路，需要跑蛋白，但怎么也不出。

   之前学习跑蛋白时，用的是师兄的肾脏组织，全细胞提取，一次就跑出来了，四个条带都有（图1）。我的核蛋白和浆蛋白用碧云天提取试剂盒提的，结果目的条带和内参都没有出，跑了好几次，内参选的沈阳万类的Lamin-B（62kDa）试用装，目的蛋白选的万类的Nrf2（68kDa）试用装（师兄师姐用同样的试用装都出结果了）。

跑核内参时第一次用错了抗体，我以为核内参用的是B-actin，结果有很淡的条带（图2-4）。全蛋白用RIPA裂解液提取的，跑了几次B-actin（43kDa），没出结果后来换的GAPDH（37kDa），今天跑了后，有很淡的条带，而且有两条，但根据Marker看的话，比正常的GAPDH指示位置要低（图5-7），我搜索了一下资料，说是蛋白降解了，后来我用师姐好的蛋白样跟我的同时跑GAPDH，结果师姐的出来了（图8）我的没有（图9），后来重提的蛋白。而且最近我看了一下论坛上大家的讨论后，说是Nrf2正确的条带应该在95-110kDa之间的，而不是68kDa，我一直是按照68kDa切得胶，但是都没有跑出来（图10-11）。我跑胶上层5%，下层12%，蛋白上样量30ug，上样体积3ul，转膜湿转恒流200mA，内参大概50min，Nrf2大概1.5h，封闭用5%脱脂乳（5g脱脂奶粉+100ml TBST）37度烘箱 2-3h，一抗按说明书1:600 冰箱4度过夜，二抗1:5000  37度烘箱 1h。快两个月了，什么结果都没有，导师催得紧，我天天做，都快绝望了，希望大家看到后能给我一些建议，万分感谢了。