外周血淋巴细胞分离+RNA提取心得分享（附大量实图）

实验菜鸟一只，历经了大半年的折腾，试验了N多方法，浪费了无数实验材料和患者标本，挨了不少导师的骂，总算是比较顺利地解决了从外周血分离淋巴细胞+RNA提取的问题，以下是个人心得体会及结果，分享给大家

主要试剂/材料选择：

1.人外周血淋巴细胞分离液：这个比较容易买到，也很便宜，国产的就可以，我用的天津XX公司的，保存时注意避强光及紫外线；操作时注意无菌操作，以免污染；

2.trizol：这个也比较容易买到，不过牌子五花八门，大家就仁者见仁智者见智了

3.其他：氯仿、异丙醇、无水乙醇，无酶水，15ml无菌离心管（买成品），大中小无酶*头（买成品），1.5ml无酶EP管（买成品）。电泳：TAE电泳液，琼脂糖粉，goldview II型染料，DNA marker（可有可无），DNA loading buffer，ddH2O

有两点值得一提：

一是最好不用反复使用的玻璃器皿，直接用一次性的塑料器皿即可，直接买

另一个是关于DEPC无酶化处理，因为DEPC具有一定毒性，且处理较复杂，所以我没有买，实验操作是在超净台内进行，只要动作迅速准确，器材不反复使用，一般来说提取的RNA质量还是比较好的。电泳相关设备的话也是一样，我只是单纯地拿酒精泡了泡，然后放37℃孵箱烘干即可

一. 外周血淋巴细胞分离：

1.紫头管（EDTA抗凝）采集2ml抗凝血，尽快运送至实验室进行后续步骤

2.取一支15ml离心管，加入3ml分离液

3.用移液*小心吸取血液样本加于分离液的液面上，如下图

4.500g离心20min。离心后，此时离心管中由上至下分为4层，第一层为血浆层（黄色），第二层为环状乳白色淋巴细胞层（图上不是很清楚），第三层为透明分离液层，第四层为红细胞层，如下图（拍的时候没注意虚焦了。。。），第二层就是我们要的东西

5.用移液*（1000ul*，调整量程至500ul）小心吸取第二层环状乳白色淋巴细胞层到另一15ml离心管中（*头悬于淋巴细胞层上方1-2mm即可开始吸，一边吸一边水平移动*头，大概需要吸3-4次才能基本上吸完），向所得离心管中加入10ml PBS，混匀细胞

6.250g离心10min，弃去上清

7.以5ml PBS重悬所得细胞

8.250g离心10min，弃去上清（必要时重复步骤7,8，就是再洗一遍）

9.以0.5ml PBS重悬细胞（这一步最好不加，否则1ml trizol+0.5ml PBS+0.2ml氯仿=1.7ml液体体积，后续步骤无法用1.5ml的EP管完成。当然，这里提的淋巴细胞可以用于其他细胞实验）

二. Trizol法提取总RNA

1.向所得淋巴细胞中（直接在15ml离心管里）加入1ml trizol，vortex震荡几秒混匀，室温静置10min

2.将液体转入一个1.5ml EP管中，加入氯仿200ul，握住EP管上下大力摇晃15s，此时溶液应为粉红色的浑浊液体，室温静置3min

3.4℃ 12000rpm 10min

4.小心转移上层400ul水相至新EP管（中号*头，吸的时候*头随着液面往下移动，切勿吸到中间层白色物质）；加入600ul异丙醇上下颠倒摇匀，室温静置10min

5. 4℃ 12000rpm 10min，擦干净管壁的水雾后，管底可见一小片白色片状沉淀，一般是在管底或者邻近的侧壁，如下图：

6.小心倒掉上清，加入1ml 75%乙醇（新鲜配置，750ul无水乙醇+250ul无酶水，加入75%乙醇后沉淀会更清晰），轻摇EP管或手指弹管壁，要让沉淀浮起来在酒精里洗澡

7.4℃ 7500rpm 5min

8.小心倒掉上清，以小*头小心吸掉沉淀周围大部分残留液体，室温下适度干燥沉淀，待沉淀开始变透明时（不要等到彻底变透明），立即30-50ul 65℃预热无酶水溶解

结果：

浓度=414.6ng/ul

260:280=1.94

260:230=2.18

三. 琼脂糖凝胶电泳：

开始的时候我没有跑电泳，PCR的结果一直不理想，和ELISA的结果相反。。。后来跑了电泳才知道自己提的RNA质量太差，导致PCR结果不可信。后来提取RNA质量稳定后的PCR就和ELISA结果一致了，所以建议大家每次提取RNA后不要嫌麻烦，都跑电泳看看RNA质量是否合格，如果不合格，建议这个标本不要做PCR，直接丢弃

步骤：

1.      取4ml 50×TAE，加入196ml ddH2O制成1×TAE（制备量根据电泳槽的大小决定，我的电泳槽比较小，不到200ml就满了）

2.      称取0.2g琼脂糖，加入20ml 1×TAE，加热至琼脂糖完全溶解（凝胶浓度为1%，厚度建议在5mm左右，可以量一下模具的大小，简单计算一下；微波炉加热高火1分钟左右，一定要像烧开水一样完全沸腾，否则凝胶会花）

3.      待凝胶液体自然冷却至不烫手后，加入2ul Goldview，混匀后将溶液倒入模具，插入梳子，放4℃里等待凝固成型后，拔出梳子，放入电泳槽，倒入电泳液至淹没凝胶（千万不要把凝胶放反了！反向电泳意味着白给）

4.      取出RNA样品5ul，加入1ul的6×loading buffer，混匀后立即点样至凝胶中

5.      将5ul marker（D2000 plus DNA ladder）点样至凝胶中（RNA电泳的话，marker其实也可以不加，只是加了之后方便看各个RNA条带的大致位置，当然大神的话一般是不加的）

6.      上机电泳（120V，时间15min，不建议电压太高，凝胶会显著发热甚至烫手，高温会降解部分RNA）

可见清晰的28s、18s和5s条带，其中28s：18s约等于2:1，证明提取的RNA质量良好，可用于后续实验（手机拍摄，28s条带上下有点糊。。。但是在电脑上看就没有）

以上就是提取外周血淋巴细胞总RNA的心得分享，欢迎大家交流学习！