RNA提取原理及常用方法----TRIZOL金典方法与流程

首先了解下RNA的分布--方便提取RNA：

一、RN A 常用提取方法总结：

1、异硫氰酸胍氯化铯超速离心法:

     1.1原理：使用蛋白质变性剂异硫氰酸胍有效抑制RN A 酶的活性，经过起始密度为1.78g/m l 的氯化铯介质，进行密度梯度超速离心，RNA沉淀于管底，而DNA与蛋白质在上清中。使用这种方法，不但能得到高质量的RN A ，而且能同时分离出细胞染色体DNA。

     1.2评价：本法对于冷冻时间长、细胞质和细胞核不易分离的组织标本以及富含RN A酶的组织细胞（ 如胰腺）的RNA提取尤其适合。此法提取的RNA的质量好和成功率高，已成为提取哺乳动物细胞RNA的常规方法。其缺点是操作复杂、流程长，一次提取的样品数量有限。

2、盐酸胍-有机溶剂法：

     2.1原理：本法有MacDonald1987年在Strohman报道的方法基础上改进而成的，适用于没有超速离心及设备的情况下提取细胞总RNA。它利用盐酸胍抑制RNA酶，匀浆裂解细胞，有机溶剂抽提去除蛋白质,通过选择性沉淀RNA分子而去除DNA。

     2.2评价：提取的RNA质量较好，但整个操作过程繁杂费时。

3、氯化锂-尿素法：

     3.1原理：本法首先由Auffray报道,利用高浓度尿素变性蛋白质同时抑制RN A酶，3 mol/L LiCl选择性沉淀RNA。其缺点是有时会存在DNA污染，LiCl沉淀RNA会丢失一些小分子量的RNA，如5S RNA等。

     3.2评价：优点是快速简捷，尤其适用于大量样品少量组织细胞的RN A 提取， 其质量可以满足No rthern分析，Oligo（dT）提取mRNA ，SI核酸酶或RNase保护实验等。本法每提取107个细胞能提取总RNA约10g。

4、热酚法：     

     4.1配方：

     4.2评价：本法主要用于少量细胞样品RNA提取，其产量不高，但简单易行。

5、快速提取法：

     本法主要用于培养细胞，通过0.5 % SDS裂解细胞，酚抽提去除蛋白质和DN A 沉淀， 快速纯化RNA。

6、细胞质RNA 提取法：

     本法主要适用于培养细胞，首先去除细胞核，然后用蛋白酶K消化蛋白质，酚/氯仿抽提去除蛋白质。操作简单，同时能进行多个样品操作，多数步骤在室温下进行，提取的RNA质量较高，可满足体外无细胞翻译系统、cDNA合成、引物延伸以及核酸酶SI保护实验。本法提取的RNA产量一般为30～500g/107 个细胞。

7、酚-氯化锂法同时提取细胞RNA和DNA：

     本法是在Elion和Warner报道的方法基础上，有Sandeep等人于1990年改进而成。它通过酚和SDS裂解细胞，变性，解聚蛋白，抑制RNase ，并用EDTA保护DNA，最后根据RNA和DNA在Li+中的不同沉淀速度，而分离DNA和RNA。整个过程在2小时内完成。RNA可用于Northern分析，DNA可用于内切酶消化以及Southern杂交实验。

8、一步快速热酚抽提法：

     基于Shomczynki和Sacchi两人于1987年报道的RNA快速提取法，美国Promega公司有机地将这些试剂组合成总RNA试剂盒，使操作更为简单方便， 并突出体现以下几个优点： 1） 将已知最强的RNase抑制剂异硫氰酸胍、b- 巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠联合使用，抑制了RNA的降解，增强了对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离进入溶液，提高了RN A 的提取产量；2）RN A 选择性地进入无DN A 和蛋白质的水相，容易被异丙醇沉淀浓缩，对大量或少量组织的细胞RN A 提取，均甚合适；3）可在3小时以内处理大量样品，省略了氯化铯密度梯度超速离心步骤及其它方法使用的长时间选择性乙醇沉淀或Li C l 沉淀。Li C l 沉淀不但会导致小RN A（< 5.8 S）的丢失， 而且Li+盐的残留还会抑制DNA的合成反应。

二、TRIZOL法提取RNA提取实验步骤：

（一）原理：

（二）步骤：

实验准备： 预冷4℃离心机(转速至少14000rpm)，取冰，戴口罩，Rnase-free*头/1.5mL的EP管；RNA专用试剂：Trizol裂解液，氯仿，异丙醇，乙醇，Rnase-free water 

在提取组织RNA时,每50～100mg组织用1mL Trizol试剂对组织进行裂解；提取细胞RNA时,先用PBS洗涤/离心沉淀细胞,每5-10 ╳106个细胞加1mL Trizol后, 反复用*吹打或剧烈振荡以裂解细胞.

2、将组织或细胞的Trizol裂解液转入EP管中, 在室温15~30℃下放置5分钟；在EP管中,按照每1mL TRIZOL加0.2mL氯仿的量加入氯仿(即为1/5体积), 盖上EP管盖子, 在手中用力震荡15秒(10次), 在室温下（15℃～30℃）放置2～3分钟后, 14000rpm（4℃）离心15分钟.

【注：离心后分为3层，RNA在上层水相, DNA在中间层, 蛋白质在下层有机相】

3、取上层水相置于新EP管中(～500uL, 用200uL的黄色*头小心吸取, 约吸取3次, 杜绝取到中间层/下层), 按照每1mL Trizol加0.5mL异丙醇的量加入异丙醇(即为1/2体积), 4℃下静置20分钟, 沉淀RNA；14000rpm（4℃）离心15分钟.

【注：若加入1/10体积的3M醋酸钠(pH：5.2)沉淀效果更好】, （通常可在室温下沉淀RNA，4℃效果更好；若是做RIP实验，则在-80℃冰箱中沉淀）

4、按照每1mL TRIZOL加1mL75%乙醇进行洗涤(即为1倍体积, 注:用DEPC水配置75%乙醇), 混合(#用移液器轻轻吹打即可,不用将沉淀打碎), 14000rpm（4℃）离心20分钟, 弃上清(#最好用真空泵吸去上清)；让沉淀的RNA在室温下自然干燥(#或在超净台中小风吹干,最好置于干净的环境中，防止灰尘杂质进入)；用45uL Rnase-free water 溶解RNA沉淀.

RNA纯度检测---分光光度计法

通过OD260/280来检测RNA纯度，OD260/280作为参考值。

OD260/280在1.9-2.1之间，可认为RNA的纯度较好；

OD260/280值小于1.8，则表明蛋白杂质较多；

OD260/280值大于2.2，则表明RNA已经降解；

OD260/230值小于2.0，则表明裂解液中有异硫氰酸胍和β-巯基乙醇法残留。

注意：如果用TE溶解或洗脱RNA，会使OD260/280值偏大。

Ps:在收集到生物材料之后,最好马上进行RNA制备工作.若需暂时储存,则应以液氮将生物材料急速冷冻后,储存于-80℃冷冻柜.

附上PCR和实时荧光定量PCR简介讲解PPT，希望能帮助正在做实验的战友们！