毕赤酵母电转问题

大家好，我最近一直在做毕赤酵母电转实验，总是转不进去，大家帮我看看。

方案一：重组质粒线性化:线性化之后进行胶回收（回收线性质粒浓度为70ng/ul）电转至GS115酵母细胞中，

GS115酵母细胞感受态制备方法：（1）活化：取保存在-80℃超低温冰箱的毕赤酵母GS115菌液，在超净工作台中划线于YPD固体培养基至乳白色单菌落长出； （2）小量培养：挑取生长良好的单菌落至YPD液体培养基5 mL，28℃、250rpm培养过夜；（3）扩大培养：在超净工作台中用移液*取1 mL活化菌液接入含100mL YPD培养基的摇瓶中，生长至OD600 值为1.3～1.5；（4）将菌液每50mL分装于灭菌的离心管中，4℃、4000g离心10min弃上清；（5）向沉淀加入50 mL的灭菌水，重悬菌体，4℃、4000g离心10min弃上清；（6）沉淀重悬于25mL的无菌水，4℃、4000g离心10min弃上清；（7）沉淀重悬于5 mL冰浴冷的1 M山梨醇溶液中；4℃、4000g离心10min弃上清；（8）沉淀重悬于0.5 mL冰浴冷1 M山梨醇中，每管80μL分装到灭菌的EP管，立即使用或-80℃冻存。电转程序：Plasmid P.pastroris cell Condition Time10μL 80μL 1.5kV 25μF 200Ω 2msec从-80℃中拿出毕赤酵母GS115感受态细胞中加入约10μL线性化质粒，用移液*反复吸吹混合后，转入到用无菌水反复洗好的冰预冷的内径为2mm的电击杯中，将电转杯放在冰上冰浴5分钟。将电击杯放入电转仪，按照设定好的转化程序（表3-5）电击，电击后在超净工作台中立即向电击杯中加入1mL 1M山梨醇，用移液*将电转杯中的产物吸到灭菌的EP管中并混匀，然后分别吸取100、200、400微升菌液涂布三块RDB平板上，正置培养至菌液吸收后。28℃，倒置培养4-6天，观察生长出乳白色菌落后，筛选阳性克隆。RDB培养基的制备：转化培养基RDB:100mL 超纯水 80ml 山梨醇 18g(186g/L) 琼脂糖2g(20g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D(20%葡萄糖)10ml, 500*B(0.02%生物素)0.2ml 100*AA(含每种氨基酸0.5%)1ml.混匀，倒平板。

 方案二：重组质粒线性化:线性化之后进行胶回收（回收线性质粒浓度为81ng/ul）电转至GS115酵母细胞中，GS115酵母细胞感受态制备方法：（1）活化：取保存在-80℃超低温冰箱的毕赤酵母GS115菌液，在超净工作台中划线于YPD固体培养基至乳白色单菌落长出； （2）小量培养：挑取生长良好的单菌落至YPD液体培养基5 mL，28℃、250rpm培养过夜；（3）扩大培养：在超净工作台中用移液*取1 mL活化菌液接入含100mL YPD培养基的摇瓶中，生长至OD600 值为1.3～1.5；（4）将菌液每50mL分装于灭菌的离心管中，4℃、4000g离心10min弃上清；（5）向沉淀加入50 mL的灭菌水，重悬菌体，4℃、4000g离心10min弃上清；（6）沉淀重悬于25mL的无菌水，4℃、4000g离心10min弃上清；（7）沉淀重悬于5 mL冰浴冷的1 M山梨醇溶液中；4℃、4000g离心10min弃上清；（8）沉淀重悬于0.5 mL冰浴冷1 M山梨醇中，每管80μL分装到灭菌的EP管，立即使用或-80℃冻存。电转程序：Plasmid P.pastroris cell Condition Time10μL 80μL 1.5kV 25μF 200Ω 2msec拿出现做毕赤酵母GS115感受态细胞中加入约10μL线性化质粒，用移液*反复吸吹混合后，转入到用无菌水反复洗好的冰预冷的内径为2mm的电击杯中，将电转杯放在冰上冰浴5分钟。将电击杯放入电转仪，按照设定好的转化程序（表3-5）电击，电击后在超净工作台中立即向电击杯中加入1mL 1M山梨醇，用移液*将电转杯中的产物吸到灭菌的EP管中并混匀，然后将其低速离心，弃800微升上清，将剩下的200微升的菌液混匀涂布于RBD平板上，其中另一管菌液离心去上清，用200微升YPD培养基重悬，涂布于RBD平板上， 28℃倒置培养4-6天，观察生长出乳白色菌落后，筛选阳性克隆。RDB培养基的制备：转化培养基RDB:100mL 超纯水 80ml 山梨醇 18g(186g/L) 琼脂糖2g(20g/L) 121℃灭菌20分钟，待温度将至60℃以后，在超净台内加入10*YNB 10ml, 10*D(20%葡萄糖)10ml, 500*B(0.02%生物素)0.2ml 100*AA(含每种氨基酸0.5%)1ml.混匀，倒平板。