手把手教你使用Imagepro-plus(10.讨厌的光密度)

如果你是第一次阅读这个系列主题，请从第一帖看起:
http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=10&id=3554359&sty=1&tpg=1&age=0

我在前面曾经说过光密度较正很难作得准确，吃力不讨好。因此想回避它。但最近却发现这个问题回避不了。只好老老实实地再琢磨一下。真的很伤脑筋，其中有些问题也是百思不得其解。只能把基本上弄明白的地方先给讲解一下。这样大家在看的时候可就费力了，真是不好意思。其实我觉得给别人讲解就是一种最好的学习方法。能够给别人讲解清楚了，才是真正弄明白了。

在计算光密度过程中出现的问题来自于图片的光强单位与测量中的光密度单位的不一致。
在计算机的图片格式中，一点象点的"亮"与"暗"是通过定义相素点的"灰度"来实现的。纯黑的点的"亮度"为零。定义其灰度gray=0。纯白点的"亮度"为255。定义其灰度gray=255。
光密度则是光学测量中的概念。OD值(optical density)叫光学密度，定义为吸收光线物质的光学密度，它与该物质的物理密度应该是线性相关的。OD值与透过它的光强之间的关系符合朗伯-比尔定律，是指数关系。
当OD值等于0的时候，对光线无吸收，透射率100%。对应照片上最亮的部位，白色，gray=255。
当OD值等于无穷大的时候，会吸收全部光线，透射率为0。对应照片上最黑的部位，gray=0

在未进行intensity校正的情况下，IPP用的是gray灰度单位。浅色处灰度值大，深色处灰度值小。这样测出的density数值是染色深的阳性区域数值小，染色浅的背景区域数值大。这就带来了极大的不方便，很容易就出现错误。

还有问题呢。因为光强与光密度之间是指数关系。在光密度不大的时候(阳性区域染色浅)阳性区域的density数值与背景density数值都处于较高水平，相差很小，作了减法以后误差增大，扣背景时就会出现极大的误差。而且造成统计数据的效果混乱。

当我们使用IOD(累积光密度=area * density_mean)表达切片上阳性物总量时，如果错用了灰度值。IOD的数值与染色深浅就成了负相关，也就是染色越深，IOD反而更小，但同时，面积越大，IOD仍然越大，这个错误的IOD值就根本不能反映"照片上阳性物质总量"了。

因此在作光密度分析时必须对程序系统的光密度值进行转换，从灰度数值转换为光密度数值单位。在平时，很多人并不清楚灰度与光密度之间的异同，甚至在发表的文献上也是胡乱使用这两个不同的概念。由上面的分析我们可以看出，实际上灰度是我们用电脑进行图象分析时所用的中间变量。而光密度才是我们真正需要使用的单位。

我们是通过对照片的灰度进行分析来测量样品的光密度的。