细胞培养过程中出现疑似细菌污染
背景:细胞第一次出现污染是在18年中,当时有个高年级同学给了我一瓶细胞,我发现培养瓶底有黑色点状物。后来经高密度传代数次后清除了污染。第二次污染出现在18年9月后,当时整个实验室70%的细胞都出了问题。跟上面反映了很多次,只让我自己想办法。当细胞出现污染时,功能试验完全不可靠,毫无意义。
措施:我收集了被污染的培养基(+1%双抗),种到无抗性皿里,用另外一个无抗性皿空白对照。结果长出了一层厚厚的菌苔。挑一点菌,搁到含有2%双抗的LB里摇,再涂双抗板挑单克隆,得到了一些菌株。尝试过用ITS引物扩增基因组,无条带。现在又自己购买了16SrDNA引物准备自己扩增下送测序。
现象:我发现细胞培养箱中的金属盘每周都灭菌,灭菌水也每次都更换,但是一周之内金属盘内就会出现漂浮的菌块,培养箱中无明显臭味。另一个培养箱金属盘里的水干的很快,而且有恶臭。
根据三四个月的观察,我总结了一下细胞当中出现的污染物的特征,希望各位战友帮忙分析下可能的病原微生物(年前好像来不及做测序了,引物发货都延期了)。
特征1:在细胞培养瓶中400倍相差显微镜观察,呈杆状或椭球状小黑点,偶见首尾二连的双截棍状。大部分贴壁,贴壁不太均匀,似乎有聚集性,少部分漂浮,可扭动运动,胰酶不能将小黑点消化下来,也很难用PBS冲掉。耐正常浓度双抗,对更高浓度的双抗也有抗性。培养基(DMEM)轻微浑浊且不变黄,有死细胞漂浮,细胞无法在出现小黑点的地方贴壁生长,最终导致细胞死亡。
特征2:在LB固体培养基上,高密度时呈淡黄色至棕色(见后文)湿润菌苔,低密度时呈淡黄色近白色圆形边缘清晰的菌落。此细菌似乎可以产生一种棕色的代谢产物,使LB固体培养基由淡黄色变为棕色,高密度时整个固体培养基完全变色,低密度时菌落周围变色。有恶臭味。
补充:我查了很多文献,但是仍没有思路。上面不愿意管这污染的问题,测序都要自己出钱买单,希望各位能提供一点思路,还有后续实验的注意事项。谢谢大家。
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 5643