总蛋白提取方法-----动物细胞/组织

柱式法动物细胞/组织总蛋白提取试剂盒，是新一代超快速蛋白质提取方法，蛋白质无丢失和可以得到完整的蛋白质谱。越来越多的证据表明最常用的RIPA缓冲液可能导致蛋白质的随机损失，产生很多难以解释的疑难数据。这些问题用离心管柱式抽提蛋白可以完全解决。离心管柱式技术结合上更强的裂解缓冲液可以有效地提取皮肤、血管、肌肉等韧性组织的全蛋白。因采用离心管柱式抽提蛋白，所以提取量最低可以低至20μl——这对一些小样本量的样本很有用。采用柱式法提蛋白无需使用匀浆仪，超声仪，也无需长时间孵育，可以将蛋白提取时间限制在5min内完成。

操作方法：

细胞样品总蛋白提取

变性总蛋白提取（SD-001）

A．非贴壁细胞

1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2.低速离心收集细胞，在1.5ml离心管中加入预冷的PBS，旋窝震荡,500xg离心2-3分钟清洗细胞。吸去上清，剩余与细胞体积相同体积的PBS。涡旋震荡重悬细胞。

3.加入表格1中相应体积的细胞裂解液，涡旋震荡裂解细胞。（细胞数量和裂解液须保证对应关系，以达到最佳提取效率）请注意：部分未完全裂解的细胞不会影响样品质量。

4.将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000xg离心30秒取出

5.立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格1，不同细胞体积应加入相应体积裂解液

B．  贴壁细胞

1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2.将预冷的PBS直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞，吸去上清。

3.按照表2中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面，用移液器吹打几次，将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000xg离心30秒取出。（如提取浓度不佳，可减少裂解液使用量）

4.立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格2，不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

天然总蛋白提取（SN-002）

A．非贴壁细胞

1.将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2.低速离心收集细胞，在1.5ml离心管中加入预冷的PBS, 旋窝震荡,500xg离心2-3分钟清洗细胞。吸去上清，剩余与细胞体积相同体积的PBS。旋窝震荡重悬细胞。

3.加入表格3中相应体积的细胞裂解液，涡旋震荡裂解细胞15秒。将离心管放置于冰上3-5分钟然后涡旋震荡10秒。（细胞数量和裂解液须保证对应关系，以达到最佳提取效率）

4.将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000xg离心30秒取出

5.立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格3，不同细胞体积应加入相应体积裂解液

  B贴壁细胞

1.将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2.将预冷的PBS直接加入培养板，培养皿或培养瓶中清洗贴壁细胞两次，吸去上清。

3.按照表4中将相应体积的细胞裂解液均匀的加入整个器皿表面，放置于冰上孵育5分钟，用移液器吹打几次，将裂解的细胞转移到预冷的离心管柱套管中，14000-16000xg离心30秒取出。（如提取浓度不佳，可减少裂解液使用量）

4. 立刻将收集管放置于冰上，弃去离心管柱，蛋白提取完成可应用于下游实验。

表格4，不同贴壁细胞量应加入相应体积裂解液

以下步骤是从15-20mg组织中提取，对于昆虫组织，例如果蝇，使用15-20个幼虫，蛹或成虫样本。如果起始量较大或者较小，需调整相应裂解液的用量比例。

1.将离心管柱及接收管套管放在冰上预冷

2.将15-20mg组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨50-60次，加入200ul细胞裂解液，继续研磨30-60次。（组织用量不要过量，无需过度研磨，裂解液可分两次加入以得到最佳效果）注意：塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干。

3.盖上盖子室温孵育1-2分钟，14000-16000xg离心1-2分钟取出。收集管里的上清是抽提的变性总蛋白。

请注意：部分未完全裂解的组织不会影响样品质量。

天然总蛋白提取（SN-002）

1.将天然细胞裂解液（SN-002），离心管柱及接收管套管放在冰上预冷。

2.将15-20mg组织放置于离心管柱上，用塑料棍扭转研磨50-60次，加入200ul天然细胞裂解液（SN-002），继续研磨30-60次。（组织用量不要过量，无需过度研磨，裂解液可分两次加入以得到最佳效果）。注意：塑料研磨棒可以重复使用，用蒸馏水彻底冲洗干净，用纸巾擦干。

3.开盖冰上孵育5分钟，盖上盖子，4℃，14000-16000xg离心1-2分钟取出。收集管里的上清是抽提的天然总蛋白