细胞共聚焦 DAPI染核(也试了Hochest33285染色液)在镜下看的清楚，但是拍不出来
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最近在做荧光分子探针检测细胞自噬流，通过共聚焦来观察单细胞中荧光探针的分布。试验设计是将细胞在12孔板进行爬片，处理细胞，然后荧光染色。用PBS洗3*5min，细胞用4%多聚甲醛固定30min, 用PBS洗3*5min. 加入DAPI染色(12孔板每孔100ulDAPI原液，在摇床上缓慢摇动，染色10min）后，用PBS洗3*5min。避光稍微晾干，后将爬片从板内抠起来，在载玻片上用抗荧光猝灭剂封片，盖盖玻片。但是拍照结果没有看到DAPI的发射光，有看到很浅的蓝光，但其分布和形状和细胞质中的荧光分子的分布和形状是一致的，也调整了拍照过程中的最大激发波长等等，依旧拍不出来。图片如下。重复做了，也同样拍不出来。其中，在多聚甲醛固定后，用Triton破膜30min,再进行DAPI染色，也同样拍不出来。。。。
图一是在普通荧光显微镜下看到的
图二是在共聚焦下看到的
求助这是哪里出了问题？重复做了好几次都是这样······
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