流式测Treg细胞的方法--求大神指导（Foxp3染不上）

1、大鼠外周血淋巴细胞分离

1）取新鲜抗凝血1ml， 与生理盐水1:1稀释混匀后，小心加入到2ml 细胞分离液液面上。

2）900g ，离心20min。

3）此时离心管中由上至下细胞分为4层：第一层：血浆层。  第二层：环状乳白色淋巴细胞层。  第三层：透明分离液层。  第四层：红细胞层。

4）小心收集第二层淋巴细胞层，加入到4ml 生理盐水中，充分混匀。

5）1500g，离心10min。

6）生理盐水洗涤细胞沉淀2次 ，即得所需淋巴细胞。

2、 流式抗体染色

1）在 5 ml 的流式管中加入 100 μl 含 1 × 106 个细胞的悬液，加入5ul对应流式抗体（如5ul的CD4，CD25），轻轻混匀。

2）37℃，避光染色15min。

3）生理盐水 3ml洗涤细胞1次，室温、1500g条件下，离心5分钟，弃上清。

4）加入 100 μl MEDIUM A，室温孵育 15 分钟

5）加入 3 ml 生理盐水，1500 g 离心 5 分钟，弃上清，涡旋振荡，使残留的液体重悬细胞沉淀。

6）加入 100 μl MEDIUM B 和推荐体积的胞内抗体（FoxP3）和/或相应的同型对照，涡旋振荡1-2秒，室温避光孵育20min。

7）离心，弃上清，用0.5ml 1%多聚甲醛重悬，4℃避光保存，24小时内流式检测。

目前Foxp3染色效果不理想，各位朋友有什么好办法，谢谢！