求助：ELISPOT失败，想请教一下原因

各位同道大家好！

最近在做IFN-γ的检测，我用的是达科为的IFN-γ elispot检测试剂盒，但是连续做了两次实验都失败了，有点郁闷，想请教一下改进方法。

我的检测结果是这样的：加入显色液以后只有部分孔显色，而大部分孔仍旧是白色，没有变红，延长时间也没用，而且有些孔只部分显色，就是靠近边缘的地方有较深的红色，中间多为白色，晾干后，均看不到斑点，一个都没有！（觉得太不可能了），想请教一下大家，为什么会出现这样的结果。

附达科为的操作步骤：

检测操作 第一天：接种细胞，加入刺激物，培养 (严格注意无菌操作)1. 预包被板的活化：每孔加入 200μL 无血清培养基或者 RPMI-1640 培养基，室温静置 5-10 分钟后将其扣出。2. 加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔， 100μL/well。 正对照孔：细胞浓度可采用 1×105 cells/well； 负对照孔：细胞浓度可采用 1×105 cells/well； 背景负对照：加入重悬细胞所用的培养基； 实验孔：样品的细胞浓度由实验者根据实验自行调整。3. 加入刺激物：10μL/well，具体如下： 正对照孔：加入阳性刺激剂工作液。 负对照孔【含背景负对照孔】：加入重悬细胞所用的培养基； 实验孔：加入实验者自己的刺激物(用无血清培养基或者 RPMI 1640 配制成 10×终浓度)。4. 孵育：所有样品和刺激物加完后，盖好板盖。放入 37℃， 5％CO2培养箱培养 16-24 小时。

第二天：培养后操作(不再需要无菌操作)1. 裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加入冰冷的去离子水， 200μL/well，4℃冰箱放置 10 分钟低渗裂解细胞。2. 洗板：甩出孔内液体，加入 1×Washing buffer，260μL/well， 停留 1 分钟后弃去孔内液体，重复六次，每一次在吸水纸上 扣干。3. 检测抗体孵育：将稀释好的生物素标记的抗体(Biotinylated antibody)工作液加入各实验孔，100μL/well。37℃ 孵育 1 小 时。4. 洗板：重复步骤 2。5. 酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素(Streptavidin-HRP) 工作液加入各实验孔，100μL/well。37℃孵育 1 小时。6. 洗板：甩出孔内液体，加入 1×Washing buffer，260μL/well， 停留 1 分钟后弃去孔内液体，重复五次，每一次在吸水纸上 扣干，然后揭开板底座，用去离子水/自来水洗涤膜底面及 底座，用吸水纸小心吸干底座及膜底残留的水迹，合上底座， 加入 1×Washing buffer，260μL/well，停留 1 分钟后弃去孔 内液体，彻底扣干孔内液体。7. 显色：将现配的 AEC 显色液加入各实验孔，100μL/well。室 温避光静置 5-30 分钟，根据斑点生成情况选择终止显色时 间。若室温低于 20℃，建议在 37℃孵箱做显色，每隔 5-10 分钟检查一次。8. 终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水/自来水 洗涤正反面及底座 3-5 遍，终止显色。将板放置在室温阴凉 处，待其自然晾干后合上底座。 9. ELISPOT 板斑点计数，并记录斑点的各种参数，做统计分 析。10. 若不能及时读板时，请将板条避光密封保存，尽量在一周 内读板。