请教PIN1筛选平台PPIase酶偶联方法中遇到的问题

有没有亲最近在做或已经建成PPIase酶偶联方法的，想请教一些问题。

1、我的底物肽段是用LiCl/TFE直接溶解的，在文献中很少有介绍底物浓度的，或是有些文献中的底物浓度很大，我的底物找公司合成的，5mg是3300多元，有些文献中蛋白浓度都是20mg/ml，想咨询一下大家用的浓度是多少

2、我用的是酶标仪测的OD值，但是酶标仪最低温度只能在20度左右，影响大吗？另外，测得空白与只加蛋白的值差距大概在几倍，吸光度大概在多少?

3、整个实验过程都需要在低温下进行吗？温度对PIN1的影响大吗？

4、我看到一些文献中的PIN1 蛋白都是原液，是不是这个蛋白的活性整体不是很好

5、我的平台是底物25mM溶解在0.47M的LiCl/TFE,糜蛋白酶溶解在0.1M的HCl，终浓度为60mg/ml，PIN1的蛋白没测定，直接用的原液，缓冲液为35mM的HEPES，PH7.9。我是先加的85ul 缓冲液，1ul Pin1，1ul DMSO，摇10min，然后加入10ul 糜蛋白酶，4ul 底物，立即测板，连续测90s。我是用的酶标仪在390nm 下测的吸光度，用的96孔板。

6、但是我测得的数据很奇怪，只有一次是符合每次反应，让后每次测数据都是一直减小的。

希望有做过的亲，能给出指点，最近一直在瓶颈期，不知道哪里出了问题，希望大家帮帮忙。