求助 WB膜蛋白内参Na,K-ATPase条带

各位大侠，帮忙分析一下：

我刚学做两次WB，取的是组织样品，用膜蛋白提取试剂盒提膜蛋白，内参用的是Na,K-ATPase，第一次上样量50μg/15μl，一抗浓度1:1250，内参曝出来如图1。

我觉得可能上样量太大，抗体浓度太高，于是第二次降低上样量为4μl（刚好样品量不够），抗体浓度为1：2500，曝光结果如图2。

无论上样量大还是小，内参都跨越好长范围，我分析不出什么原因，求各位大侠帮忙，拜托

同一批样品跑目的蛋白（图3），后三组没有条带，我分析后三组应该是提蛋白时出问题，但前两组能出条带，说明蛋白应该没有降解的原因，那图2内参为什么没有明显条带呢？

有同学说我可能上样时吸到沉淀了，不知道是不是这个原因呢，该怎么改进？

谢谢！