回收率试验

最近本人在通过PROTEIN A 测定细胞上清的抗体含量。经过测定细胞上清的抗体含量在1.0mg/ml左右。应领导要求要做一个方法学验证。线性本人做了，对准品按等倍稀释的规则(对准品是在1XPBS中），从2.2mg/ml, 1.1mg/ml,0.55mg/ml,0.275mg/ml,0.1375mg/ml,做了线性。R2=0.99996，从线性来看还可以。当我做到回收率时，就出现问题了。我回收率是这样做的。

第一种做法：

1）精密吸取待测样（细胞上清，浓度约为 1.0mg/ml)45ul+5ul的1XPBS，重复测定3次

2）高浓度：精密吸取待测样45ul+5ul的浓度2.2mg/ml的对准品。重复测定3次

3）中浓度：精密吸取待测样45ul+3ul的浓度为2.2mg/ml的对准品+2ul的1XPBS。重复测定3次

4）低浓度：精密吸收待测样45ul+1ul的浓度为2.2mg/ml的对准品+4ul的1XPBS。重复测定3次

然后我按公式去算回收率。得到的结果是：高浓度为127%，中浓度为96%，低浓度为88%左右。

我又重复做了几次，其回收率值都差挺多的。请各位指教，我这试验是否设计合理。药典是不是规定定量的回收率要在98%-102%之间才算合格。

第二种做法：

1）精密吸取待测样（细胞上清，浓度约为 1.0mg/ml)45ul+5ul的1XPBS，重复测定3次

2）高浓度：精密吸取待测样45ul+5ul的浓度2.2mg/ml的对准品。重复测定3次

3）中浓度：精密吸取待测样45ul+5ul的浓度为1.1mg/ml的对准品。重复测定3次

4）低浓度：精密吸收待测样45ul+5ul的浓度为0.55mg/ml的对准品。重复测定3次

根据公式我的回收率还是达不到98%-102%。请各位同仁指教。

另外，对于药典的规定如下：

请各位指教，我这试验是否设计合理。如果不合理，我该如何设计。此外我该怎么理解上图药典的规定。谢谢！