【原创】小鼠原代肝细胞分离培养经验

       最近逛园子的时候发现有关小鼠原代肝细胞分离培养的帖子不少，但很少有帖子能够提供完善、详实的实验方案，不少初来乍到的战友在看完大量帖子之后可能仍然无法顺利完成小鼠原代肝细胞的分离培养。在这里首先给有需要的战友提供一个国外网站：http://www.mouselivercells.com/，这个网站中提供了详细的分离培养小鼠原代肝细胞的各种试剂、步骤，并有视频、图片等作为参考。然后，结合这个网站的内容和自己的经验，谈一下小鼠原代肝细胞的分离，希望更多的战友能顺利获得想要的结果。

       分离前准备工作

       1.准备好所有必要的试剂（详细的试剂和耗材清单见附件）；

       2.最好在无菌环境中分装胶原酶，轻柔涡旋，并在37℃环境下使胶原酶溶解30-60分钟。注意，虽然胶原酶溶解迅速，充分溶解30分钟以上的胶原酶具有更加稳定的消化效率（基于细胞总产量）。此时可以将HBSS（即前灌液）置于水浴锅中预温。

       3.准备好动物试验台。如果能提供无菌环境当然是最好的，但是最开始的几个操作步骤并不要求采取严格的无菌措施。所有非多孔表面需要喷洒70%-75%酒精消毒。

       4.蠕动泵管道用70%-75%乙醇循环运行消毒至少20分钟，随后用双蒸水漂洗两次以去除残留的乙醇。确保用于实验操作的平台已经完成充分的清洗和消毒。

       5.准备两个吸水台垫，其中一个置于工作台面上，另一个覆盖在操作平台上（如硬纸板或泡沫塑料）。因为实验采用的是非循环灌注，所有的灌注液体都将随用随弃，因此建议采用凹槽式的结构，这样废弃的液体可以流入凹槽中，避免在灌注过程中造成各种不必要的麻烦。

       如果有需要，可以将操作平台放入浅壁容器内（浅壁容器可以临时盛放灌注后的废弃液体）。这种措施对于小鼠灌注是选择性使用的（一方面需要操作平台需要提供足够的支撑强度，另一方面小鼠的灌注量相对较少，吸水垫基本可以将废弃的灌注液完全吸收），但对于大鼠的灌注则可能是必要的（因为大鼠灌注的弃液量远远多于小鼠）。

       6.将一个10cm培养皿（无菌）置入操作台中，用来盛放灌注结束后游离下来的肝脏。

       如果使用非一次性双层75微米过滤器（即滤网），确保它已预先完成无菌处理。

       7.以下物品置于冰上预冷：

       盛有分散液的容器（即预冷分散液）；

       50ml无菌锥形管。

       8.确保下列物品为预温的：

       HBSS（即前灌液）；

       消化液/胶原酶（即消化液）。

       9.准备好套管针。

       10.在原代分离即将开始前，用HBSS（即前灌液）预充蠕动泵的管道，确保灌注系统中无气泡，尤其要注意蠕动管之中不要有气泡。如果蠕动管中出现气泡，则需要保持蠕动泵运转直到使气泡排出，不要在乎因此失去的几毫升前灌液。

       在调校好蠕动泵并确保没有肉眼可见的气泡后，将蠕动泵流速调节至缓慢（1～2ml／min）后关闭。

       至此，分离前的准备工作完成。

       插管，灌注、消化

       1.麻醉小鼠。推荐异氟烷，因为它对肝脏代谢的影响最小（条件所限，我们采用腹腔注射戊巴比妥或水合氯醛的方式进行麻醉，注意避免刺伤内脏器官）。

       2.腹部向上将小鼠固定于工作平台上；胶带或大头针固定四肢。为尽量减少因痛苦导致的麻醉动物过早苏醒，胶带是首选。

       3.彻底清洁腹部和胸部区域，用乙醇或碘剂消毒。此步骤既要求迅速又要求消毒彻底，因为动物的毛皮是第一个潜在的污染源。如果动物有排便，一定要清理和消毒沾染粪便的区域。

       4.用剪刀和直钳取下腹部切口，剪开表皮和肌肉层，尽量直接切至肌肉层（因此建议选用锋利的剪刀）。注意不要刺伤任何脏器，尤其是肠道。剪皮时提起皮肤的边缘，减少伤及脏器的风险。

       5.继续直线开腹直到肝脏、门静脉（PV）和下腔静脉（IVC）充分暴露。最后一刀停留在腹左侧（施术者左侧）近脐部，方便后续灌流时血液的排出。

       6.启动蠕动泵（此时应已设定为缓慢灌注模式），等待套管针前端有液体流出后，伴随着液体的流出，迅速地并一气呵成地将套管针置入门静脉中。

       如果置管成功，肝脏应迅速变白，一旦确认插管成功，当立即剪断下腔静脉释放系统（门静脉-肝脏-下腔静脉）压力，并且注意使灌注液自鼠体左侧流出腹腔（强烈建议有助手协助来完成此步骤）。一旦下腔静脉被剪断，肝脏将不再变白，而是变的颜色暗淡。在明亮的直射光下比较容易观察到肝脏变白的情况。

       ·如果肝脏没有立即变白，尤其是在下腔静脉已经剪断之后仍未变白，最常见的两个错误是：存在隐匿性的气泡阻塞，或者操作者失误（如勿入胰管而未能准确将针置入门静脉）。前者更为常见，因此在插管时建议持续低流速泵注HBSS（前灌液），液体的持续流出可以消除隐匿在套管针伞部或其他不宜观察到的部位的气泡）。

       或者，也可以采用下腔静脉插管、剪断门静脉的方法逆行灌注。Klaunig等人（1980）发现门静脉插管灌注将获得更高的细胞得率，虽然二者差别并不是特别大，所得细胞的存活率也并无显著差异。而且由于下腔静脉的管径明显粗大，从下腔静脉穿刺置管显然更加容易。但我们的经验还是建议门静脉插管，下腔静脉引流。

       7.当剪断下腔静脉后，立即将灌流速度加大到7-9ml/min，让所有HBSS通过肝脏灌注，流速可以1-2ml/秒的速度递增（建议让助手监控并调节流速）。

       通过对下腔静脉轻轻施加压力可以快速检测穿刺置管是否成功，在灌注速度大于8ml/min时，所有的肝叶会立即开始膨胀。

       8.当盛放HBSS（前灌液）的容器（不是蠕动泵的管子）中液体即将耗尽时，向容器中倒入70ml消化液（含酶消化成分），没必要而且不建议在此过程中停止运行蠕动泵。很明显容器中残存的HBSS会稍稍稀释最开始灌注时的胶原酶的浓度，但这并无大碍。将剩余的大约20ml消化液倒入10cm培养皿中并迅速盖上皿盖，这一步要求迅速（同样的，该步骤可以在助手的帮助下变得非常高效）。

       一个增加细胞得率并且减少总消化时间的小技巧是定期按压下腔静脉（在灌注时可以进行5-10次，每次按压约5秒钟，即暂时阻断灌注液的排出通道）,这种方法可以使肝脏反复膨胀，肝内增加的压力有助于肝脏的消化，从而提高产率（强烈建议将此操作纳入标准操作流程进行）。

       9.随着消化过程的进行，可逐渐观察到肝脏缓缓膨胀，产生这种现象的原因应该是胶原酶破坏了肝内弹性纤维。当这种肿胀出现时，就意味着已经非常接近消化结束了。

       注意，如果执行了步骤8，即通过定期按压下腔静脉来观察肝脏随着对门静脉压力的施加与释放发生膨胀或收缩，则不能使用步骤9的方法来判断肝脏的消化进程。因此，如果此时要评估肝脏消化程度，可以遵循如下原则：随着消化过程的进行，在每一个下腔静脉施压和释放循环结束后，肝脏的回缩程度都会因为弹性的破坏而减小。

       10.没有确定的标准来判断消化是否已经完成，一般而言，一旦肝脏开始膨胀，再进行1-3min的灌注消化就足够了，在肝下叶或许会看到小的清亮透明的部分。肝脏可能出现湿透的条纹布样纹理。

       11.让肝脏消化到何种程度几乎完全取决于你可以在何种程度上熟练地切除器官。如果使用的胶原酶消化条件比较温和，延长1-2min的消化时间并无大碍。

       12.当消化效果满意后，关掉蠕动泵并小心地拆下套管。

       肝细胞提取和纯化

       1.用直镊小心理顺各个肝叶并暴露出肝脏的中央部位。找到连接各个肝叶的纤维束，换用弯镊钳夹这个较为结实（安全）的纤维束聚集部位。这一步操作要稳，不能急躁，因为找准这个点可以为完整的分离肝脏提供了坚实的保障。

       2.抓稳肝脏后，将肝脏稍稍拉向你（尝试在肝脏后面，即靠近胸腔的一侧游离出肝脏的各个肝叶），暴露胸腔和连接肝的各种结缔组织。小心仔细地切断这些连接，慢慢地把肝脏向前和向外游离。这一步可能需要更换新的剪刀，因为此前的一把剪刀可能已经沾染了小鼠的血液和毛皮。此时同样需要注意小心操作，避免伤及任何内脏器官。

       3.一旦足够的结缔组织连接被切断，适当的施力就可以将肝脏完全游离出小鼠的腹腔。不需要撕开胆囊，但如果你想去除胆囊，那就在此时将胆囊去除。

       4.立即将肝脏浸入盛有消化液的10cm培养皿中，盖上盖子（助理完成）。此步骤完成后我们建议转移至细胞台（或生物安全柜）中按照严格无菌的要求继续进行后续操作。

       5.使用2副镊子（要么是新的无菌镊，要么将之前的镊子用酒精和/或火焰处理之后再用），撕裂肝叶; 如果此前没有去除胆囊，则此时应避免弄破胆囊。

       如果此前肝脏消化良好，此时应该看到分散液随着肝脏的撕裂而变浑浊，肝脏可以大部分溶解在分散液之中。在理想情况下，残存下来的都是结缔组织残渣，但实际操作时通常会有一些肝叶也残存下来。如果撕裂肝脏后，大块的肝叶都没有被消化，在分散液中几乎没有形成云雾状浑浊，那就是消化过程中出了问题。

       6.将肝脏撕开后，用镊子夹住肝脏的中央部位（刚刚的纤维束点），轻轻摇动以分散残留的细胞。丢弃所有残留的固体颗粒，包括胆囊（如果你选择不在步骤3中剔除它，胆囊在此过程中应保持完整; 如果胆囊破裂，则说明你的力量过大或镊子不慎刺破了胆囊）。

       理论上胆囊的破裂不会对肝细胞活力或功能产生任何不良影响，但有关这一点目前尚无实验证实。因此，为了保证实验条件的一致性，建议尽量避免胆囊破裂。

       提示：此时所有涉及肝细胞处理的步骤必须使用无菌器材并且动作要轻柔。此时的肝细胞非常脆弱，并且易受剪切力的损伤。

       7.用25mL移液器在原10cm培养皿中吹打悬浮液三次（我们使用的是巴氏管，注意轻柔吹打）。

       如果使用不锈钢过滤网，此时应注意将过滤网的底部预湿，或者可以在开始撕裂肝脏之前就预先润湿滤网的底部。操作很简单，将2-3ml分散液涂布到过滤器的底部，轻轻旋转过滤器直到整个底面湿润即可，丢弃残余的液体。

       8.通过70-75μm滤网过滤细胞悬浮液。

       如果使用过滤器，您的细胞将存留在95毫米皿中; 将其转移到无菌、干净的50mL锥形管中。若使用猎鹰管过滤器，此时您的细胞已经转入50mL锥形管内并准备使用。

       9.在荡平式离心机中以50×g、4℃离心2分钟。离心机可不必预冷，但预冷的效果更好。

       10.用无菌巴氏管吸弃上清（混浊、不透明，上清内主要是间质细胞和部分细胞碎片，如果需要同时分离提取间质细胞，比如星状细胞之类的，可以用此步骤的上清继续分离），加入25mL冷培养基。轻轻吹打几次以溶解底部的细胞团，并重悬。

       11.重复步骤9和10两次以上，共洗涤3次。第二次洗涤后上清应接近透明，第三次洗涤后上清应完全清亮。

       12.最后一次离心完成后，吸弃上清并加入25-45mL冷培养基。保持足够的细胞悬液浓度，这样就不必在细胞铺板之前重新离心，但也不要使细胞悬液浓度过高，以免造成计数困难。巴氏管轻柔重悬细胞。用移液器吸取80uL重悬后的细胞悬液用于计数和台盼蓝染色。

       染色，定量和铺板

       1.向80uL细胞悬浮液中添加20uL 0.4％的台盼蓝。上下摇动几次使其与细胞悬液充分混合。

       2.室温染色约1min。

       3.再次轻柔吹打数次，吸取10uL悬液滴加到血细胞计数板上。

       4.显微镜下计数所有未蓝染、非空泡样细胞。注意台盼蓝超强的活力（尽快完成计数）。值得一提的是：被染色的细胞当然是已经挂掉的，但未染色的细胞也可能已受到损伤或濒死。我们的经验是，活的、健康的肝细胞具有明亮，清澈，平滑的外观，相对较小并且有聚集性。受损、死亡的细胞通常肿胀并且看起来粗糙、呈颗粒状。准备进一步培养的肝细胞活力应至少超过85％，以确保不同实验批次间的一致性。

       一般而言8-12周龄的C57小鼠，每只可分离出的原代肝细胞总产量在3000-5000万个。平均产量应该约为4000万，产量低于3000万/鼠表明操作过程出错（很可能要归咎于消化/插管不当）。

       5.在计数细胞后（注意校正因台盼蓝造成的25％的稀释），对铺板细胞悬液进行稀释。稀释终浓度一般是预估每10mL总体积种1个板，其中含后300万活细胞；或使细胞浓度为300,000个/mL。

       6.推荐的铺板细胞量：

       10cm 培养皿：8mL (7-9mL均可)

       6孔板：1.7mL/孔 (1.5-2.0mL 均可)

       12孔板：800uL/孔(700-820uL 均可)

       24孔板：360uL/孔(340-450uL 均可)

       现已证实这些推荐铺板体积和浓度可以获得最一致的铺板结果，因为在上述条件下细胞向中央或边缘聚集的趋势最小化。

       7.在所有细胞铺板之前，建议先铺一个孔/皿，随后在显微镜下仔细检查，确保实际细胞密度接近根据你的计数所获得的预期。充分震板（前后或左右直线震荡，不要采用涡旋震荡方式），给细胞30秒的稳定时间，然后再次观察。一般当活细胞比例超过90％时，将有大约60％-70％的细胞发生初始融合。这种融合水平允许细胞间相互接触，同时保持足够的空间用于肝细胞生长至其完整大小，并且最终形成90％-95％的融合。

       8.在确认细胞密度正常并进行过各种必要的调整后，将细胞铺板。确保每1-2分钟重悬一次细胞，因为肝细胞密度较大、沉淀迅速。一般而言，每种2个12孔板或1个24孔板后应该重悬浮细胞。

       9.在将细胞放入培养箱之前，以线性方式（即直线前后或左右）彻底震板; 这个步骤很关键，因为细胞倾向于直接下沉并贴壁，并且，如果细胞在这时不能以均匀的单层铺开，将会造成铺板后细胞分布不均与。

       10.细胞铺板后置于37℃孵箱45-60分钟。

       后续处理和过夜培养

       1.细胞贴壁后，用低糖DMEM洗涤一次，更换含血清培养基（10％FBS）继续孵育3-4小时。

       若此时细胞健康，细胞核在低倍镜下可见。细胞仍然是圆的，但略增大; 可注意到细胞簇倾向于比单个细胞更快地复原（贴壁和展开更快）。

       在孔的侧面进行（贴壁操作），不能直接在细胞顶部（孔或皿的中央）操作。

       2.铺板4-5小时后，建议将更换为无血清培养基，助于保持细胞形态，且无血清培养基对原代肝细胞无不良影响。应用血清最关键的时间是铺板后的第一小时，已有研究证实血清中所含的蛋白有助于细胞贴壁。

        贴一下自己分出来的小鼠原代肝细胞（培养24h，密度有点太大了……），抛砖引玉。

       最后贴一下国外大神分离的原代小鼠肝细胞图片。希望战友们实验顺利！