【求助】蛋白质纯化降解严重，求帮助

蛋白质纯化，用高压细胞破碎仪破碎的，仪器设定温度是4℃，离心收集上清液也在4℃，过ni柱是在4℃冷室进行。反正就是全程都是低温的，破细胞之前也加了PMSF。但是！！用250mM 咪唑洗脱的时候就开始降解了。。。我一直找不到原因，求帮助！！图在下面

红色圈出的是目的条带，35kd那个位置的条带一直都去除不了，应该不是降解的，除此之外全都是降解的。。。。老板让我每过一步buffer就留一点点ni柱的beads（见图的标注），wash是40咪唑，E是250咪唑，所有buffer的盐浓度都是200mM。