【求助】mTOR pathway WB实验结果不好，请求各位大神帮助。具体情况见帖。

1. CST 9964 mTOR pathway kit中mTOR, p-mTOR, Rictor, Raptor 我都做过，但结果不尽人意，显影时呈现出的问题是有条带但八个泳道中经常只有一个条带或者最多有过三个，不知还有没有人做过这个试剂盒，结果如何？对于我出现的问题您有什么改善建议？

2. 蛋白样品来源：小鼠皮层全蛋白、睾丸全蛋白，暴露方式为自由饮用铅水、NAC干预。上样量各泳道统一为50微克。

3. 电泳液为常规电泳液，分离胶浓度用过6%和8%。电泳时间：90V，30min; 120V, 90~120min.跑到loading buffer到玻璃板最下面但还有2~8mm空隙。

4. 湿法转膜，转膜采用290mA, 3h or 300mA 3h.电转液中甲醇浓度采用过1%，5%，10%。

5. 洗膜时间5m*3.

6. 封闭液：非磷酸化蛋白采用5%脱脂奶粉溶于TBST中，磷酸化蛋白采用5%BSA溶于TBST中。封闭时间为1h，RT。

7. 一抗严格依照说明书配制，4℃轻微摇晃过夜孵育。

8. 二抗来自Millipore公司。

9. 显影液来自genview公司。

下图均为我实验组近期实验结果，其目的蛋白均为mTOR。

如有大神做出来了mTOR, p-mTOR, Rictor, Raptor（条带清晰有趋势），愿闻其详，感激不尽。