求助：flox/flox，cre敲除小鼠敲除效率的鉴定问题

各位大神好，我最近遇到了个难题，想请大家帮忙解决一下！

实验背景：我们托公司用Crispr/Cas9法构建了A基因的全身条件诱导敲除小鼠，公司将flox鼠和cre鼠进行杂交得到flox/flox，cre+小鼠、flox/flox，cre-小鼠以及flox/+,cre+小鼠3种基因型小鼠（F3代），这些小鼠运回后做了以下实验：

1. 对flox/flox，cre（+）小鼠和flox/flox，cre（-）小鼠给予腹腔注射Tamoxifen（75mg/kg，一天一次，连续5天，等待7天进行检测）诱导A基因敲除。具体分组如下图：

（1）7天后剪鼠尾提取DNA做PCR进行A基因的基因型鉴定，若A基因未敲除，扩增片段为1.3kb，若A基因敲除，扩增片段为400bp，PCR引物和退火温度都是公司提供的。结果发现：A组小鼠（280、281、300）目的基因敲除，C组（278、294、321）小鼠目的基因未敲除，但奇怪的是B组小鼠（302、304、323）也有部分敲除，结果如下图，我困惑的是B组小鼠腹腔注射玉米油不应该出现目的基因敲除，但基因鉴定结果却显示有部分敲除，不知问题出在哪里？

（2）我把A、B、C3组小鼠的心脏组织提取蛋白（A基因在心脏、肾脏、肺脏中表达较高），做western进行蛋白水平鉴定，目的蛋白大小为85kD或105kD（分别为活化和非活性形式），但做出来结果发现杂带较多，在70kD和100kD之间有两条带，根据蛋白大小判断发现A组小鼠的目的蛋白并未敲除，结果如下图（2次的结果），蛋白上样量为60ug，western细节：配10%分离胶和5%浓缩胶，加样后20mA恒流跑电泳，300mA转膜3小时，5%脱脂奶粉封闭1小时，孵1抗过夜，1X TBST洗5遍，每遍5分钟，孵2抗1小时，再1X TBST洗5遍，每遍5分钟，最后发光。我的问题是：我做的western是不是有什么问题？我的目的条带位置判断的对吗？为什么A组小鼠的基因鉴定敲除而蛋白水平没有明显变化呢？

2. 将F3代小鼠进行繁殖，2种方案：flox/flox，cre+ X flox/flox，cre-；flox/+,cre+ X flox/flox，cre-。

（1）对10天左右的F4代新生小鼠进行剪脚趾标记并提取DNA进行基因型鉴定，除了对flox是否纯合、cre阳性阴性进行鉴定外，我也将A基因进行了PCR（未进行Tamoxifen诱导），结果发现部分小鼠的A基因已经敲除了（PCR产物为400bp），结果如下图，这种结果让我非常奇怪，正常应该是在给予Tamoxifen诱导前目的基因未敲除（1.3kb），在给予Tamoxifen诱导后才会出现敲除条带（400bp）。出现这种情况的原因是什么呢？

（2）根据上图结果，在F4代中的敲除和未敲除小鼠中各挑取3只取心脏和肾脏组织提RNA逆转率为cDNA，做RT-PCR，引物是针对敲除外显子设计的，做出的CT值如下（未敲除组：20、27、44，敲除组：55、57、58），结果发现组内差异比较大，总体来看敲除组和未敲除组肾脏组织的A基因表达水平无明显变化，敲除组心脏组织的A基因表达水平反而比未敲除组要高。由于同种组织的GAPDH表达量差的有点大，这个实验我还需要再重新做一次逆转重复一下这个实验。但是除去差别较大的样品，敲除组的表达量也没有降低，这让我很困惑，大家觉得是什么原因呢，有什么需要改善的地方吗？

（3）我把上面6只小鼠（20、27、44、55、57、58）的心脏和肾脏组织提取蛋白进行western，结果与上面做的western结果类似，在70kD和100kD之间仍有两条带，两组小鼠的蛋白表达量无明显差异。

我现在最困惑的是明明基因水平鉴定已经敲除的小鼠，进行RT-PCR和western发现mRNA水平和蛋白水平都没有敲除，请大家帮忙看一下，出现这种情况的原因是什么，实验方面我需要做哪些改进，或者大家有什么好的建议吗？万分感谢！