关于LC3II 及AB的问题和我得到的信息

如题，做自噬的western时候考虑用LC3座检测指标，想通过LC3I/II的比值看自噬，但在试剂订购过程中发现LC3抗体存在A  A/B两种，查阅之后发现，哺乳动物中有三种LC3，包括LC3A、LC3B和LC3C，它们在自噬过程中存在相关的翻译后修饰。LC3蛋白首先会在合成后立即在其羧基端被Atg4所剪切，产生细胞浆定位的LC3-I。在自噬过程中，LC3-I会被包括Atg7和Atg3在内的泛素样体系所修饰和加工，产生分子量为14kD的LC3-II，并定位到自噬小体中。这样，自噬小体中存在的LC3，和低分子量的LC3-II都被当做细胞发生自噬的分子标志(autophagy marker)，并且LC3-II的含量和发生自噬的程度成正比。LC3B作为LC3的一种，同样可以用作自噬的分子标志。

然后呢，基本上大家做western自噬检测LC3选择LC3B就差不多了。

LC3B抗体识别的是总LC3B (total LC3B)，可以检测内源性的LC3B，可以同时识别LC3B-I和LC3B-II，分子量依次分 别为16 kD和14 kD

• 那么小弟的问题就是，是不是经过二抗孵育显影之后，片子相当于16和14kd的位置上上会出现两条条带，分别是LC3B-I和LC3B-II？这两个分子量大小相差这么大在胶片上真的能区分开吗？

• 再一个问题就是关于marker的问题，由于想要节省经费，我选择用非预染的marker，但是非预染的marker是不是应该在跑胶之后单独切下marker的跑道，单独进行染色和脱色备用啊？然后再根据marker显色的条带和目的蛋白分子大小，判定目的蛋白的情况和决定切胶时留取哪一部分。

• 还有一个问题，就是marker是不是买的时候就含有上样缓冲液，上样的时候不用再加了？