CRISPR/Cas9基因敲入试验步骤（二）sgRNA的设计及退火

一、在线网站的选择

1、http://crispr.mit.edu/
2、http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/
3、http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html
4、http://www.e-crisp.org/E-CRISP/
5、http://flycrispr.molbio.wisc.edu/
6、http://www.flyrnai.org/crispr/,Drosophila
7、http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp
8、http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php
9、http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx
10、http://cas9.wicp.net/
11、http://cbi.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR植物
12、http://crispr.igenetech.com/细菌

靶位点的设计基于以下基本原则：

（1）以 G 开始，这是由 gRNA-puro 载体上的U6 启动子决定的；

（2）尽量避开 GC 富集区域，以防止甲基化对互补配对可能的干扰；

（3）选择特异性位点，降低脱靶概率；

（4）靶位点设计在外显子上，在基因上游越靠前越好。许多人类蛋白表达基因并不存在完全符合上述设计要求的特异性靶位点，即便某一基因存在特异性靶位点，也不能保证以该靶位点设计的 gRNA 能起高效引导作用。 

二、sgRNA接头的使用

现在使用cas9质粒，常用BbsI和BsmBI酶切形成粘性末端链接sgRNA，所以我们根据我们使用cas9质粒酶切位点的不同选择合适的接头。

BsmBI的接头如下图所示

BbsI

具体的酶识别位点可以去NEB官网查看

合成gRNA具体操作步骤：

1.设计gRNA模板

1)在NCBI网站获得目的基因cDNA、mRNA,标注出外显子区,注意要把不同的外愚子分别标注出来。找出蛋白N端保守区,範序列选择在保守区的前端相对应的外显子。

3)将外显子序列提交于麻省理工大学张峰gRNA设计网站。

4)选出一对靶序列,并综合以下几个因素:分数较高,反向相反,距离相差几千bp,最好在17或18bp位置的碱基为G。

5)得出靶序列的反向互补序列。

6）在正向序列(将紧接NGG的序列规定为正向序列)前加上CACCG几个碱基,如果正向序列第一个碱基为G,则不需要再加G。

7)在反向序列前加上AAAC碱基,在末尾加上C碱基,如果正向序列第一个碱基为G,即反向最后一个碱基为C,则不需要再加C。

8)合成修饰后的正反向序列

三、sgRNA的退火及双链的形成

Phosphorylate and anneal the oligos in a thermocycler by using the  following parameters: 37 °C for 30 min; 95 °C for 5 min; ramp down to  25 °C at 5 °C min–1.

四、sgRNA的识别