微生态研究在临床能干什么？

先举个例子—量体温，病人的口腔或腋下放上温度计后可以得到体温信息，基于这个信息，医生判断这个病人是否出现体温异常，结合其他的信息和临床经验，做出进一步的医疗决策，比如做病原化验，更换药物等。

微生态与量体温，在本质上是一样的，都是通过借助仪器，得到的人体局部信息，以辅助临床决策。微生态研究的对象是环境中（粪便标本，体液标本，病房，手术器械表面等），所有病毒，细菌，真菌，寄生虫等微生物的总和。微生态研究的数据结合样本信息后（疾病状态，生理生化特征等），通过数据分析得到微生态信息，研究者使用这些信息进行临床决策（或发表论文）。

图1 信息流-微生态研究和量体温

微生态研究的新方法——高通量测序及信息分析，对于大多数刚开始接触这一块的研究者们来说，可能是一个特别深奥乃至无法理解的新方法！这些其实都不是事儿，你拿到CT报告后，会把CT仪器拆开研究下吗？当然不会，只需要知道影像结果和受试者疾病之间的关系即可。同理，对于做微生态研究的临床医生和研究者来说，各种陌生词汇，如基因组测序、生物信息学等，只是“获得信息的方式”。研究者才是决定“这些信息是否有价值”的主宰，所以只需关注一个点：“这些信息对我有什么用”，不要过度纠结数据产生和分析的过程。

如果你看不懂数据分析人员提供的信息，不是你的责任，而是他们展示信息的能力太差。好的数据分析结果提供的信息，会清晰，简单，无废话。研究者的宝贵时间要用于阅读文献，建立微生态信息和疾病之间的关系，这是决定研究成果档次最关键的部分，没有人比你更了解你所在的领域，而数据分析和测序只能协助你，但不能完全代替你完成这部分工作。

先谈下微生态研究提供的三种信息： 1）有哪些微生物，有多少。2）环境中微生物的功能。3)不同微生物之间的关系。

1 有多少种类和数量的微生物？

可以看到环境中所有微生物的组成以及他们的比例，因为传统的实验室分离培养只能得到常见的微生物，而99%的微生物无法得到体外纯培养物。测序富集到微生物(不考虑微生物是否仍然存活)后，直接提取基因组序列，不需要培养，因此可以得到更全的信息。更重要的是，测序分析还可以观察到未知的，从没有人发现过的微生物，下次谈到高通量测序时我们再说其原理。

PS:微生态研究只能得到微生物的比例，而不是绝对个数。比如，我们从所有微生物中，观察了100个细菌，有10个菌是双歧杆菌，我们就可以说双歧杆菌占了10%，而不能说这个环境中有10个双歧杆菌。仅仅依靠基因组测序的微生态研究，不能做到绝对定量。

2 微生物做什么。

拿到所有微生物的基因组测序分析后，可以得到很多基因（如何得到？下次再说），如果能知道这些基因做什么，参与了哪些代谢反应，就能推测所有的微生物在做什么。推测"这些基因具有什么功能"的术语叫做注释(annotation)，有现成的工具来干这个活。一般使用NCBI的COG数据库，里面收录的基因的功能都经过实验证实，所以相对于其他数据库的结果更加可靠。虽然数据库中的基因已经达到了几百万个，但常见的基因功能分类就20多种而已。COG在2003年第一次公开数据，第二次更新是2015年。这十年中，微生物基因组的数量从几百株增加到了5万多株(2015年一年内就增加了2万株)，微生物基因组的注释工作，基本都会使用到 COG数据库，10年间竟然没有一个公认的可替代的数据库出现，可见COG数据库十分难做，非常可靠。（向COG 致敬！）

图2 COG的功能组成，字母缩写代表一类功能，大部分基因的功能（S,R）都是未知。

3 微生物之间的关系。

噬菌体捕食细菌的特异性非常强(体外实验可以证实)，大量的研究都证实益生菌有抑制外来病原菌和发病过程的能力。第一个问题：怎么从几千个微生物，找到类似噬菌体和益生菌这种有潜在价值的微生物？

这需要先用到统计学，找到与病原体相关的细菌或者噬菌体。举个例子，假设我们要寻找能杀灭病原菌P的微生物，我们首先需要计算所有的微生物，和这个病原菌之间的相关性。如果在所有的样品中，病原菌A越多，微生物B越少（同时这个病原菌越少，而这种微生物B越多）。这时，A和B就可能存在对抗关系。常见的微生物之间的关系只有8种，如下图所示。我们一般最关心的是捕食/寄生(Parasitism/predation)和共生(Mutualism)。共生也很有用，有些微生物必须要有共生体才能生存（体外分离培养的基础）。从数据上显示就是，如果样品中没有微生物A，也就不会有微生物B。下一步的工作就是得到感兴趣的微生物的纯培养物，做体外实验以证明他们确实有抑制病原体，或者抑制发病进程的能力。

图3 微生物之间的相互关系

小结

1 微生态提供信息，这些信息可以用于临床决策。

2 微生态的信息主要有三种：环境中有哪些微生物？他们有哪些功能？他们之间如何相互作用。

3 并不是有了高通量测序，才有了微生态研究。早期的研究是分离培养技术，后来发展到扩增靶基因转染质粒测序，再后来我们才广泛使用高通量测序进行微生态研究，在后续的分享中会讲到：为什么要用高通量测序做微生态研究。

4 研究者要把主要时间花在：阅读文献，建立微生态信息和疾病之间的关系。这是决定研究成果水平高低最关键的部分。

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很多临床医生质疑：花那么多钱和时间，微生态研究能让我的病人早点康复吗？很遗憾，目前看到的微生态研究结果(即使发表在nature/science的论文)，对解决临床实际问题毫无帮助。究其原因有两个：

1 临床病人不单只有一个疾病因素。举个例子，糖尿病研究中，我们想了解哪些肠道菌群与空腹血糖浓度相关，可以找到一组初发糖尿病人，并确认健康对照的体重年龄和糖尿病人无偏差（假定健康组非常健康）。为保证两组之间尽可能只有糖尿病一个差异，还需确定疾病组没有高血压，脂肪肝等因素。科研纳入研究的对象存在选择偏好，和临床面对的病人完全不同。临床实践中的糖尿病人会有很多其他症状，比如肥胖，脂肪肝。临床和科研面对的受试者组成完全不同。要解决这个问题，可以把研究分成两个阶段：第一期，将严格挑选得到的样本进行测序分析得到结论；第二期，从门诊找一批没有筛选，随机挑选的糖尿病人，用他们的样本同样进行测序和分析。如果两个阶段得到的分析结果一致，则说明结论可靠，也就有了走向临床运用的基础。。

2 研究者没有提出临床问题。微生态领域有两个项目的影响力很大，美国的Human Microbiome Project I (HMP1)以及欧洲的 MetaHit，发起者都是传统的微生物学家。他们设计之初，不是为了解决某个具体的临床问题，而是利用最新的研究工具，探索一个几乎未知的领域。在这些新知识的基础上，HMP第二期 (HMP2) 启动了3个项目（http://www.hmp2.org/overview/；另外还可参见帖子：【资料】人类微生物组计划第二阶段-人类微生物组整合计划：人体健康与疾病期间微生物组-宿主组学数据的动态分析（【资料】人类微生物组计划第二阶段-人类微生物组整合计划：人体健康与疾病期间微生物组-宿主组学数据的动态分析）），包括：怀孕&早产，IBD肠炎，前驱糖尿病。如果项目的初衷是为了解决临床问题，一定要由熟悉临床的研究者主持，没有谁比临床医生更了解人类健康需面临的题。如果项目的初衷是产生描述性的知识，发表论文没有任何问题，但还需要更多的数据用于临床实践。

上面文章中介绍了微生态研究带来三种信息：1)微生物有哪些。2)微生物在干什么。3)微生物之间的关系。前两种信息可以关联到四种临床问题，注意每一种临床问题都有自己的适用范围。

一 病原诊断

微生态研究可以得到样品中所有细菌，病毒，真菌，寄生虫的信息。病原诊断适用于难分离到病原体的感染类疾病，比如神经中枢感染(脑脊液)，未知原因发热(血清)，尿路感染(尿液)，腹膜炎(腹水)等，病灶通常是闭合性或者半开放性，正常情况下为无菌状态或者微生物组成很简单。有三个技术问题需要特别注意：

1 样品污染：要特别取样环境中存在的不相关微生物，解决方式是采集工具要严格消毒，取样同时用无菌蒸馏水制作阴性对照。

2 背景噪音：如果疾病的发病进程很快，我们会认为真正的病原菌大量繁殖占有绝对优势地位，但要注意样品中本身可能就有一些固定的和疾病无关的无害微生物，比如脑脊液中有无害病毒，尿液中会有来来自生殖道中的乳酸杆菌。解决方案：1）有阴性对照或不相关样品对照，用来鉴别无关微生物。2）结合病人的流行病史做出判断。

3 RNA病毒：有报道认为超过一半的腹泻和未知原因发热由RNA病毒引起，如打算做这方面的研究，就要在样品收集时要加入灭菌的RNA保护液，以便实验中提取RNA，因为RNA极易降解。

二 疾病诊断

大部分疾病的判定标准可以两类。1）数值性，如糖尿病（OGTT），肥胖（BMI），高血压。2）分类型，如癌症（病理或者影像），胃溃疡（胃镜）等。有些疾病分级和严重程度相关，如肝纤维化分级，比如肝癌，有多个信息：肿瘤的直径；基于肿瘤大小分的早，中晚期；原发或既发。

此类研究的目的是关联微生态菌群和疾病判断标准，以辅助甚至替代原有的诊断标准。分析流程如图4所示。

图4 疾病诊断的微生态研究

整个研究分为两个阶段。发现：用严格匹配无偏差的样品得到差异；验证：用新纳入的随机样品进行验证，并判定验证的准确率。此类研究的适用范围为：疾病的判定手段对病人有创伤，成本高，或者需要经验很丰富的医生。举个例子，肝纤维化分级，如果肠道微生态检查可以辅助甚至替代肝穿，就非常有价值，再比如早期结直肠癌肿瘤，如果粪便微生态能辅助肠镜，受试者也会愿意使用。如果现有的诊断手段简单易行可靠，就没必要用微生态做疾病判定，比如糖尿病，肥胖等，此类疾病可从侧重于微生态菌群的功能组成和发病机制关联，但这更偏向基础型研究，和临床使用很远。

三 风险预测，

风险预测和上面提到的疾病诊断完全是两个概念。

风险预测：根据现在的信息，预测受试者将来可能的疾病风险。比如受试者发现自己有BRC1 基因，觉得以后可能会发展为乳腺癌，会要求医生给她切掉，但她此时没有患癌，一般的临床医生可能也不会主动建议病人作出选择。

疾病诊断：根据现在的信息，判断受试者现在的疾病状态。比如医生根据喉部CT平扫，判断病人此时是否罹患食道癌。

如果某类疾病有高风险，但仍未发病的人群，比如IGT和糖尿病，HP感染者和胃癌等，就适合做这类研究，但要注意这类研究的周期很长，比如肝硬化发展成肝癌是一个很长期的过程，一定要等到同一个个体发展成疾病状态，才算完成样品收集。解决方案是要先纳入大量的样品并定期随访，挑选最后患疾个体做数据分析。用微生态研究预测疾病风险非常有趣，发高影响因子论文的可能性很大。但是要注意即使知道了风险，还需要开发出预防手段，这也是一个研究方向。举个例子，我们用肠道菌群预测受试者罹患糖尿病的可能性，假设我们得到的风险是90%（还有个问题，他什么时候会得糖尿病？），但受试者目前血糖正常，不可能按照糖尿病的标准治疗，这就需要新的药物或治疗手段。

四 个性化用药

由于个体之间差异很大，标准治疗方案不一定对所有人群都有效。微生态研究可以辅助临床医生制定出最优治疗策略，图5是此类研究的研究流程，我们只纳入了单个治疗方案，实际研究中可以纳入多个方案，并需要纳入阴性对照（不做任何医疗处理），以观察人体对此类疾病是否有自愈能力。

图5 个性化用药/治疗的微生态研究流程

研究目标很明确，用病人治疗前的微生态数据，预测治疗方案是否对受试者有效。整个实验分为两个周期。发现：纳入受试者后，先收集治疗前的样品，然后使用治疗方案，经过一段时间后（明确好时间，比如1个月或3个月），用预后评估，评价治疗方案对受试者的有效程度，然后将受试者分为“有效”和“无效”两组，寻找他们之间的差异。如果能启动新的研究，整合入新的治疗方案，比如另一种降血糖药物，抗肿瘤药物等，就能建成完整的数据库用于临床实际，用于辅助临床医生构建最佳治疗方案。有几个细节要注意：

1 一定要明确好“有效”和“无效”的定义，而且有些“有效”是可以量化的，比如降血糖的程度，体重下降的程度等。数据类型不同，数据分析方法也不同。可以参考我们在上一小节中对“疾病状态判定”的理解。

2 此类研究最大的难点在于病人征集和随访。要花很多时间招募受试者并随机分为不同的治疗组。

3 因为是随机选择，治疗方案不一定最适合受试者，不能根据自己的临床经验随意增减纳入者，这样会带来很大的偏差。解决方案：要有多个治疗方案备选，对受试者可能有较大副作用的可以提前删去。

4 在治疗过程中，要有专人定期随访受试者的饮食和用药记录，最好要求受试者不要有地理迁徙和大的饮食结构变动。

小结：

1用新的临床样品，甚至背景状态非常混乱的样品，能否得到证实已有的结论，走向临床实际运用的第一步。

2 研究者没有临床问题，就不可能解决临床问题。

3 微生态研究提供的大量信息，并不是对所有的疾病都有用。每种疾病都有自己的特点，研究者要明确“我想要什么”，再去做实验设计。

4 测序成本高，周期长，是制约走向临床使用的一个大瓶颈。但科技发展的一个趋势是，有生命力的产品随着研发经费的投入会更便宜快捷。

作者：李昂 / 邮箱：LIA@ZJU.EDU.CN

合并后稍有编辑