【全文翻译】男性血浆中XIST基因未甲基化的DNA片段可作为睾丸癌的肿瘤标志

我给《The Lancent》翻译的进展文章，见柳叶刀中文版，2004；363：40-42
男性血浆中XIST基因未甲基化的DNA片段可作为睾丸癌的肿瘤标志
Takahiro Kawakami, Keisei Okamoto, Osamu Ogawa, Yusaku Okada

睾丸生殖细胞瘤（TGCTs）是20-40岁男性中最常见的恶性疾病。基于肿瘤内的未甲基化的DNA谱，我们揭示了一种睾丸生殖细胞瘤的DNA肿瘤标志。通常在睾丸生殖细胞瘤内，无论XIST基因是否表达，此基因的5`端主要被低（或次）甲基化。然而在男性的体细胞内，此基因包括其最小的启动子和其保存的重复序列均通过CpG位点被完全甲基化。通过鉴定男性血浆中XIST基因未甲基化的DNA片段可用以诊断TGCTs。

柳叶刀2004；363：40-42

请看注释

睾丸生殖细胞瘤（TGCTs）是青年男性中最常见的一种恶性疾病，20-40岁为发病高峰期。睾丸生殖细胞瘤的发病率在上个世纪急剧增加。大量的超甲基化基因在人体肿瘤中已被不断报道。这些基因的DNA甲基化谱可潜在地用作为不同类型肿瘤的标志。然而有报道显示睾丸生殖细胞肿瘤比体组织肿瘤的甲基化频率低[1]。这种未甲基化的DNA谱十分明显，特别是在精原细胞瘤型的睾丸生殖细胞肿瘤中[2]。
我们过去研究表明[3]，XIST基因在有些睾丸生殖细胞肿瘤中表达而在其它睾丸生殖细胞肿瘤中不表达，并且在精原细胞瘤型和非精原细胞瘤型的睾丸生殖细胞肿瘤中，无论XIST基因是否表达，额外X染色体上X连锁的基因群多为低（或次）甲基化。因此，为睾丸生殖细胞肿瘤，特别是精原细胞瘤型的睾丸生殖细胞肿瘤寻找一个基于甲基化（特征）的DNA标志可能比较困难。但是我们假定，如果那些对睾丸生殖细胞肿瘤特异的非甲基化的DNA区域真的存在的话，它们即能用以作为潜在的DNA标志。我们之所以对XIST基因尤感兴趣是由于其在男性生殖细胞中（能够）表达。
我们从日本滋贺医科大学及其附属医院的患者中获得了３１例手术切除的原发性睾丸生殖细胞瘤组织样品和２５例匹配的血浆样品。这些肿瘤可分类为精原细胞瘤型（１８例）或非精原细胞瘤型（１３例）二种。此外，还收集了健康男性和女性志愿者的外周血淋巴细胞和２４例男性非睾丸生殖细胞瘤患者（１４例肾细胞癌和１０例膀胱癌）的血浆样本。所有血浆样品均在肿瘤治疗前采集，且经患者书面同意。
我们利用亚硫酸盐定序法，对３例男性、３例女性的外周血淋巴细胞样品和８例睾丸生殖细胞瘤组织样品（４例精原细胞瘤，４例XIST基因表达和不表达的非精原细胞瘤）中的XIST基因５`端的56个CpG位点的甲基化谱进行了初步比较（图A）。利用TOPO TA克隆试剂盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)，PCR扩增、克隆及测序经亚硫酸盐修饰的DNA。PCR体系25 µL包含GeneAmp反应缓冲液II (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)， 1.5 mmol/L MgCl2，200 µmol/L dNTP, 每条引物终浓度0.8 µmol/L，1 U 的AmpliTaq Gold聚合酶。PCR反应在Peltier 热循环仪-200 (MJ Research, Watertown, MA, USA)上进行，退火温度：第一循环50ºC，第二循环55ºC。

原发性睾丸生殖细胞瘤组织和睾丸生殖细胞瘤患者血浆中XIST基因5`端的甲基化谱XCR=XIST基因保守重复（序列）. MSP or M=甲基化特异PCR. USP or U=非甲基化特异PCR. PBL=外周血淋巴细胞. SE=精原细胞瘤. NSE=非精原细胞瘤. A: 通过亚硫酸氢盐测序显示的人XIST基因 5′端 CpG位点图谱. 箭头=转录起始. 白棒=编码区.开放框=最小的启动子. 灰棒=XIST保守重复. 竖线=56 CpG 位点. B:一例男性、女性外周血淋巴细胞和四例睾丸生殖细胞瘤患者XIST基因 5′端甲基化状况。每一行代表一个独立的克隆（每样品8个）。填充环=非甲基化CpG位点；开放环=非甲基化CpG位点C: XIST基因甲基化特异PCR和非甲基化特异PCR的结果

引物 (编号)
亚硫酸盐测序引物
I区  外向 1, 5′-GTTTAGAAATGAAGTTTATTTTTA (U50908, 6264-6287)
  外向2, 5′-CTCAAAATATTCCAAATACTTTC (M97168, 243-265)
  内向 1, 5′-TTGTTTTTATTGGGTAAATTTTG (U50908, 6336-6358)
  内向2, 5′-CTCAAAATATTCCAAATACTTTC (M97168, 243-265)
II区  外向1, 5′-GGAATTATTTTTGGTGATATTTTT (M97168, 297-320)
  外向2, 5′-ATTTTTTCATCCATAAAAAACAC (M97168, 753-775)
  内向1, 5′-TTTATTTTTTTTTTTATATTTTG (M97168, 348-370)
  内向2, 5′-ATAAACCAAAATATTAAAAATTC (M97168, 545-568)
III区  外向1, 5′-GGAATTATTTTTGGTGATATTTTT (M97168, 297-320)
  外向2, 5′-ATTTTTTCATCCATAAAAAACAC (M97168, 753-775)
  内向1, 5′-GGGTATAGGATATTTGTTGATTT (M97168, 511-533)
  内向2, 5′-CAAAAAAACAAAAATTAAAACAAAT (M97168, 676-700)
IV区  外向1, 5′-GGGTTTTGGATATTTGTTTTTTT (M97168, 618-640)
  外向2, 5′-TACCTAACCTACTATCATCCATC (M97168, 998-1020)
  内向1, 5′-ATTTGTTTTAATTTTTGTTTTTTTG (M97168, 676-700)
  内向2, 5′-CCTCCCTAATTTAACTTAACACAA (M97168, 971-994)
V区  外向1, 5′-TAAGGGATTAGTTAAAAATGGAAGGTTAGG (M97168, 1138--1167)
  外向2, 5′-ACAATCCAACACTATCCATCCCACCTTTTC (M97168, 1578-1607)
  内向1, 5′-AAAGATTAAGGTGTAGGGTTTAAAATG (M97168, 1168-1194)
  内向2, 5′-AAAACACACAACAAAAACAAAAAAAC (M97168, 1411-1436)
VI区  外向1, 5′-TAAGGGATTAGTTAAAAATGGAAGGTTAGG (M97168, 1138-1167)
  外向2, 5′-AATCAATTCCACCCCCATTTCTAATTAATT (M97168, 1618-1647)
  内向1, 5′-TTGTTAAGTGGTTAGTATGGTGGTGGATAT (M97168, 1321-1350)
  内向2, 5′-ACAATCCAACACTATCCATCCCACCTTTTC (M97168, 1578-1607)
甲基化和非甲基化PCR的特异性引物
非甲基化正向 5′-TGTTTTTTTGTTTATTGGGGTTGTG (M97168, 691-715)
非甲基化反向 5′-ACAACTAACCTAAACCAAATTATACA (M97168, 944-970)
甲基化正向 5′-TGTTTTTTTGTTTATCGGGGTCGCG (M97168, 691-715)
甲基化反向5′-CGAATTATACGACAAATCTAAAATAACG (M97168, 927-954)

基于亚硫酸盐基因组测序的结果,我们设计了甲基化和非甲基化特异性引物来分析血浆和肿瘤组织中的DNA(图A)。 10 mL血样加肝素收集。密度梯度离心分离血清和淋巴细胞。用Qiagen UltraSens Virus Kit (Qiagen, Basel, Switzerland)纯化血清DNA。2 mL血清过同一纯化柱。我们用亚硫酸钠处理修饰纯化的DNA后，用甲基化和非甲基化特异性引物进行PCR扩增。非甲基化扩增片段大小为280bp，甲基化扩增片段大小为264bp。用体系中的H2O为模板作阴性PCR对照。分别以63ºC 和 60ºC为退火温度，进行45个循环的甲基化和非甲基化特异性的PCR扩增。PCR产物经2%的琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色后在紫外灯下照相。凡有可见PCR条带者视为阳性，无可见PCR条带者视为阴性。每次实验，以来自正常男性和女性外周血淋巴细胞修饰的DNA为对照。所有样品PCR结果均经实验重复确证。
对血浆和肿瘤组织中阳性XIST基因未甲基化的DNA片段频率进行Fisher’s确切概率检验。
亚硫酸盐基因组测序结果显示，男性和女性外周血淋巴细胞中所有检测区的甲基化谱均不同（图B）。此结果与小鼠中的发现一致，即体细胞活性X染色体上沉默的XIST等位基因的5`端均完全被甲基化，而失活X染色体上表达的XIST等位基因完全没有被甲基化。无论XIST基因是否表达，睾丸生殖细胞瘤此基因的相应受检区主要表现出被次甲基化的DNA谱（图B）。睾丸生殖细胞瘤通常被认为起源于胚胎生殖细胞系，也可能源自原始生殖细胞系。然而人和鼠中这些细胞的Xist/XIST基因的甲基化状况至今并不清楚。睾丸生殖细胞瘤中XIST基因的转录调节模式可能与过去研究的报道相似，即鼠的未分化胚胎干细胞的XIST基因的转录活性不受其甲基化状态的影响。这样看来，DNA甲基化可能不是睾丸生殖细胞瘤或其祖细胞中XIST基因程序性表达的最主要调控机制，这与在女性体细胞中的状况明显不同。
用甲基化和非甲基化的DNA引物分别扩增，仅女性外周血淋巴细胞可见有非甲基化的XIST基因的信号（图C；表）。与亚硫酸盐基因组测序的结果一致，31例精原细胞瘤型和非精原细胞瘤型的睾丸生殖细胞瘤组织中的30例(97%)显示有非甲基化的XIST基因的DNA信号，这明显高于来源于健康男性的外周血淋巴细胞的情况（p〈0.0001〉。在某些睾丸生殖细胞瘤组织中可能由于污染进了正常细胞的缘故也可检测到甲基化信号（图C；表）。
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  XIST 基因  阳性非甲基化  阳性甲基化
  表达频率  XIST DNA 片段  XIST DNA 片段
    频率  频率
正常人外周血淋巴细胞  
总样品数  14  14  14
男性  0/7  0/7 (0%)  7/7 (100%)
女性  7/7 (100%)  7/7 (100%)  7/7 (100%)
睾丸生殖细胞瘤组织      
总样品数  31  31  31
精原细胞瘤型  14/18 (78%)  18/18 (100%)  11/18 (61%)
局部病灶  12/14 (86%)  14/14 (100%)  8/14 (57%)
转移性病灶  2/4 (50%)  4/4 (100%)  3/4 (75%)
非精原细胞瘤型  5/13 (38%)  12/13 (92%)  10/13 (77%)
局部病灶  3/7 (43%)  6/7 (86%)  5/7 (71%)
转移性病灶  2/6 (33%)  6/6 (100%)  5/6 (83%)
总数  19/31 (61%)  30/31 (97%)  21/31 (68%)
睾丸生殖细胞瘤患者血浆DNA    
总样品数  ND  25  25
精原细胞瘤型  ND  10/14 (71%)  6/14 (43%)
局部病灶  ND  7/11(64%)  5/11 (45%)
转移性病灶  ND  3/3 (100%)  1/3 (33%)
非精原细胞瘤型  ND  6/11 (55%)  5/11 (45%)
局部病灶  ND  2/6 (33%)  4/6 (67%)
转移性病灶  ND  4/5 (80%)  1/5 (20%)
总数  ND  16/25 (64%)  11/25 (45%)
男性非睾丸生殖细胞瘤患者血浆DNA  
总样品数  ND  24  24
肾细胞癌  ND  0/14 (0%)   10/14 (71%)
膀胱癌  ND  0/10 (0%)   6/10 (60%)
总数  ND  0/24 (0%)  16/24 (67%)
ND=未检测
血浆和肿瘤组织中的非甲基化XIST DNA 片段的检测
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我们比较了睾丸生殖细胞瘤患者的血样与24名男性非精原细胞瘤患者（14名肾细胞癌和10名膀胱癌）的血样。25名睾丸生殖细胞瘤患者中有16名可检测到(64%)非甲基化信号，这明显高于在男性非精原细胞瘤患者中检测的情况（0/24，p<0·0001）（图C；表）。器官限制性睾丸生殖细胞瘤的非甲基化信号明显不同于转移性睾丸生殖细胞瘤（9/17（53%））对7/8（88%））。24名非精原细胞瘤型患者中有16例(67%)检测到甲基化信号（表）。
这些初步的数据表明，鉴定男性血浆中非甲基化的XIST基因DNA片段可用以诊断睾丸生殖细胞瘤。然而，我们需进一步专注于增加这种检测的敏感性（例如用实时PCR）。如果这些结果通过增加敏感性在大量研究中得以证实，非甲基化的XIST基因DNA片段可能成为一种有前途的工具用以诊断和监测精原细胞瘤型和非精原细胞瘤型的睾丸生殖细胞瘤患者。
投稿者：
K Okamoto设计了此项研究并与T Kawakami共同撰写此报道。T Kawakami进行了分子遗传学分析。Y Okada对包括患者的选择和临床样品收集的临床部分研究进行了指导。O Ogawa对数据和最终报告的阐述进行了协助。

与此有关的抵触（不一致）陈述：
无公开报道

致谢
此研究得到日本教育、科学和文化部（资助号：13470332, 13671647）和Shimadzu科学基金、Uehara纪念基金和Yamanouchi代谢紊乱基金资助。此研究的发起者并未参加研究设计，数据收集、数据分析、数据阐释或报告撰写工作。

1．  Costello JF, Fruhwald MC, Smiraglia DJ,等，异常CpG岛甲基化呈现出非随机性和肿瘤类型特异性的分布模式。Nat Genet 2000; 24: 132-38. [PubMed]
2．  Smiraglia DJ, Szymanska J, Kraggerud SM, Lothe RA, Peltomaki P, Plass C.。精原细胞瘤型和非精原细胞瘤型的睾丸生殖细胞瘤中明显的后生（渐成）遗传性显性。 Oncogene 2002; 21: 3909-16. [PubMed]
3．  Kawakami T, Okamoto K, Sugihara H,等，超数X染色体和XIST基因表达在睾丸生殖细胞瘤中的作用。Cell 1994; 77: 41-51. [PubMed]
4．  Norris DP, Patel D, Kay GF,等，证据显示随机性和印迹性Xist基因表达受控于基因有优先性甲基化。Cell 1994; 77: 41-51. [PubMed]
5．  Beard C, Li E, Jaenisch R. 体细胞而非胚胎细胞中Xist基因的甲基化活性丧失。Genes Dev 1995; 9: 2325-34. [PubMed]

滋贺医科大学泌尿系，小樽, 滋贺 520-2192,日本(T Kawakami MD, K Okamoto MD, Y Okada MD)；京都大学医学研究院，泌尿系，京都 (O Ogawa MD)

通讯作者：Dr Keisei Okamoto (e-mail:keisei@belle.shiga-med.ac.jp)