【求助】荧光定量qPCR各样本间内参差值控制在多少才合适呢？

荧光定量PCR内参差多少是可以接受的？
荧光定量PCR是常用的针对mRNA水平的研究方法，可以同时检测多种目的基因的mRNA水平，为文章增加说服力。
我们做的实验方法大致如下：取小鼠淋巴结细胞制成单细胞悬液，分选CD4 T细胞（通过磁珠分选得到，各样本所得细胞总数基本一致，大约在10E6左右），利用经典的Trizol方法提取RNA，其质量在各样本间基本一致且符合要求，选取2ug RNA，用40ul反转录体系（Takara反转录试剂盒），37度10分钟，85度5秒，12度结束反转录。得到的cDNA加一倍的稀释液用于荧光定量PCR检测，荧光定量的体系采用SYBR作为荧光物质。
然而荧光定量PCR历来以敏感著称，在实验中经常会遇到一些问题。我们遇到的问题是内参表达（内参的Ct值）在各样本间表达不均一，请看下图（这是不同样本内参的相对表达量，可以看出内参的表达相差在10倍左右）

下边是各样本的原始Ct值，可见各样本3个副孔间的差值还是可以接受的

内参用的引物是HPRT，引物是直接向所用模型的文章作者发Email要的，产物大小及溶解曲线都没问题（下图是溶解曲线）

关键问题是：内参作为参照，应该在各个样本表达量差不多，那我这个样本算不算“差不多”呢？（自高表达的Ct值是21.05 最低表达Ct值26.09）
以这种内参为参照，我要检测的目的基因是GATA-3（CD4 T细胞向Th2分化的关键转录分子），它的相对表达是这样的：

前边6个样本（2开头的）GATA-3表达升高是符合预期的（小鼠模型是一种Th2反应，取的引流淋巴结中CD4细胞会有更多的Th2细胞，也就会有更多的GATA-3这个转录蛋白，其对应的mRNA水平也会更高），后边3个样本（3开头的）是没有处理的小鼠的淋巴结，这一mRNA水平表达低符合预期。但是以各自内参为参照，用△△Ct方法来比较各组目的基因的相对表达就会得到下面的结果：

这一结果显示GATA-3在实验组（2开头的六个）相对表达有高有低，有的甚至低于对照组，为什么单看相对表达是符合预期的，而减去内参后就出现了上述结果呢？把各样本的相对表达都列出来可以发现目的基因和内参的表达在每组都是差不多的（如下图）：

也就是说目的基因虽然在实验组升高了，但是其内参表达也升高了，这是造成结果有高有低的原因所在。
以上只是N多次结果的一个例子，在众多次的尝试中，只要内参在各样本间差值能控制在3之内，那么结果是很好的（但是毕竟只是少数）。
可以排除的原因如下：
1、 RNA的提取方法，我们试过Trizol和组织试剂盒的方法，RNA的质量都是经过检测的，基本都是一致且合格的。
2、 引物，一方面引物来自模型创造者的作者，另外对引物的专一性、产物大小都经过检测；而且我们换用了不同的内参引物都得到了差不多的结果
3、 荧光定量PCR机器，科里有两台荧光定量PCR仪，都试过，都有这个内参表达差异比较大的问题
我也在不断思考为什么会这样，因为提取的总RNA中绝大多数会是核糖体RNA，mRNA只占不到5%，反转录时各样本根据测得的浓度算出2ug用来反转录（根据反转录体积的大小可以调整RNA的用量），这样能保证反转录中mRNA水平的基本一致吗？比如A样本2ug RNA有100份RNA，其中5%是mRNA，B样本2ug有100份RNA，其中5%是mRNA，那么B样本会因为没有炎症其RNA中mRNA水平就达不到5%吗？
到底内参在各样本间的差值控制多少是可以接受的呢？如何做才能减少内参在各样本间的差值呢？根据RNA的浓度来调整用于反转录的RNA体积可以控制各样本间内参表达的均一吗？开始取的组织大小均一重要吗？（比如我们都取小鼠的半只耳朵，或者同样位置的淋巴结，但有时候炎症在各个组之间是不同的，虽然都是一只耳朵，炎症重的会比炎症轻的里边含有的组织多）
是否用Western Blot更加稳定，各位站友有何建议能让实验更加稳定吗？

此外，上边这些图都是用Bio-rad公司的iQ5这个软件做的，分析起来非常方便，而且任何电脑都可以安装，为使用Bio-rad的机器检测的样本的分析提供了极大的便利，有兴趣的站友可以一起讨论一下对这个软件的心得。