【求助】核蛋白western blotting 目的各种不出条带求助！！！

 本人做核蛋白的western blotting，文献上均用的RIPA提总蛋白做的。。本人用凯基强效RIPA+PMSF提总蛋白做。。。一抗为abcam的推荐为稀释比例为1比1万到5万。。本人现做1比1000,目前条带如下：

这个是今天刚做的。。第一个是阳性对照120ug左右。。后面是梯度110ug,80ug。

这个是前几天做的。。不小心把内参切掉了，但是第一个泳道任然能明显看到内参。期间前后做多次。。目的均没有出现条带，除了9月14日出现如下图条带：

内参

下面为疑似目的条带。。前面为阳性对照。。后面为实验组。。因为是预实验，均上最大浓度，160ug,120ug ,108ug ,93ug.共4个泳道。。但是居然5个泳道都有条带（最后一个泳道没有加蛋白）。。且条带均没有分开，不知道是不是确实是目的条带？跟abcam官网条带确实在同一位置。。但是后面重复的时候目的条带再也没有出现过。。。现在最大上样浓度已经跟这次的一样了。
本人电泳浓缩胶跑90V，30min,分离胶130V，1h30min 到2H,转膜80到90min湿转。TBST配置5%脱脂奶粉封闭。洗膜用TBST10分钟，3次。一抗4摄氏度过夜。。第二天早晨室温摇床1H，二抗室温1H。 赛默飞公司ECL发光液。

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请各位大神给指导下。。已经做了一个月了。。一点进展都木有，非常感谢！！！