乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定

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一、原理
试样经沉淀蛋白质、除去脂肪后，用镀铜镉粒使部分滤液中的硝酸盐还原为亚硝酸盐。在滤液和已还原的滤液中，加入磺胺和N-1一萘基一乙二胺二盐酸盐，使其显粉红色，然后用分光光度计在538nm波长下测其吸光度。将测得的吸光度与亚硝酸钠标准系列溶液的吸光度进行比较，就可计算出样品中的亚硝酸盐含量和硝酸盐还原后的亚硝酸总量；从两者之间的差值可以计算出硝酸盐的含量。
二、试剂和材料
测定用水应是不含硝酸盐和亚硝酸盐的蒸馏水或去离子水。
注：为避免镀铜镉柱中混入小气泡，柱制备、柱还原能力的检查和柱再生时所用的蒸馏水或去离子水最好是刚沸过并冷却至室温的。
（1）亚硝酸钠（NaNO2)。
(2）硝酸钾（KNO3）。
（3)镀铜镉柱
镉粒直径0.3一0.8mm。也可按下述方法制备。
将适量的锌棒放入烧杯中，用40gL的硫酸镐(CdSO4·8H2O）溶液浸没锌棒。在24h之内，不断将锌棒上的海绵状镐刮下来。取出锌棒，滗出烧杯中多余的溶液，剩下的溶液能浸没镉即可。用蒸馏水冲洗海绵状镉2一3次，然后把镉移入小型搅拌器中，同时加入400mL0.1mol/L的盐酸。搅拌几秒钟，以得到所需粒度的颗粒。将搅拌器中的铜粒连同溶液一起倒回烧杯中，静置几小时，这期间要搅拌几次以除掉气泡。倾出大部分溶液，立即镀铜。
(4）硫酸铜溶液：溶解20g硫酸铜（CuSO4·5H2O)于水中，稀释至1000mL。
(5)盐酸一硫酸铜-氨水缓冲溶液：pH值为9.60一9.70。用600mL水稀释75mL浓盐酸（质量分数为36％一38%）。混匀后，再加入135mL浓氨水（质量分数等于25％的新鲜氨水）。用水稀释至1000mL,混匀。用精密pH计调pH值为9.60－9.70。
(6)盐酸（2mol/L)：160mL的浓盐酸（质量分数为36％一38%）用水稀释至1000mL。(7)盐酸（0.1mol/L)：50mL2mol/L的盐酸用水稀释至1000mL。
(8)沉淀蛋白和脂肪的溶液：
①硫酸锌溶液：将53.5g的硫酸锌（ZnSO4.7H2O）溶于水中，并稀释至100mL。
②亚铁氰化钾溶液：将17.2g的三水亚铁氰化钾[K4Fe(CN)6·3H2O]溶于水中，稀释至100mL。
(9)EDTA溶液：用水将33.5g的乙二胺四乙酸二钠（Na2C10H14N2O3·2H2O)溶解，稀释至1000mL。
(10）显色液1：体积比为450：550的盐酸。将450mL浓盐酸（质量分数为36％一38%）加入到550mL水中，冷却后装入试剂瓶中。
(11)显色液2：5g/L的磺胺溶液。在75mL水中加入5mL浓盐酸（质量分数为36％一38%)，然后在水浴上加热，用其溶解0.5g磺胺（NH2C6H4SO2NH2)。冷却至室温后用水稀释至100mL。必要时进行过滤。
(12）显色液3:1g/L的萘胺盐酸盐溶液。将0.1g的N-1一萘基一乙二胺二盐酸盐(C10H7NHCH2CH2NH2·2HC1）溶于水，稀释至100mL。必要时过滤。
注：此溶液应少量配制，装于密封的棕色瓶中，冰箱中2一5℃保存。
(13)亚硝酸钠标准溶液：相当于亚硝酸根的浓度为0.001g/Lo
将亚硝酸钠在110一120℃的范围内干燥至恒重。冷却后称取0.150g，溶于1000mL容量瓶中，用水定容。在使用的当天配制该溶液。
取10mL上述溶液和20mL缓冲溶液于1000mL容量瓶中，用水定容。
每1mL该标准溶液中含1.00μg的NO2-。
(14）硝酸钾标准溶液，相当于硝酸根的浓度为0.0045g/L。
将硝酸钾在110一120℃的温度范围内干燥至恒重，冷却后称取1.4580乙溶于1000mL容量瓶中，用水定容。在使用当天，于1000mL的容量瓶中，取5mL上述溶液和20mL缓冲溶液，用水定容。每1mL的该标准溶液含有4.50μg的NO3-。
三、仪器和设备
所有玻璃仪器都要用蒸馏水冲洗，以保证不带有硝酸盐和亚硝酸盐。
（1）天平：感量为0.1mg和1mg。
(2）烧杯：100mL。
(3）锥形瓶：250mL、500mL。
(4）容量瓶：100mL、500mL和1000mL。
(5）移液管：2mL、5mL、10mL和20mL。
(6）吸量管：2mL、5mL、10mL和25mL。
(7）量筒：根据需要选取。
（8）玻璃漏斗：直径约9cm，短颈。
(9）定性滤纸：直径约18cm。
(10）还原反应柱：简称镉柱。
(11)分光光度计：测定波长538nm，使用1-2cm光程的比色皿
(12)pH计：精度为±0.01，使用前用pH7和pH9的标准溶液进行校正。
四、分析步骤
4.1制备镀铜镉柱
(1)置镉粒于锥形瓶中（所用镉粒的量以达到要求的镉柱高度为准）。
(2）加足量的盐酸以浸没镉粒，摇晃几分钟。
(3)出溶液，在锥形烧瓶中用水反复冲洗，直到把氯化物全部冲洗掉。
(4）在镉粒上镀铜。向镉粒中加入硫酸铜溶液（每克镐粒约需2.5mL)，振荡1min,
(5)出液体，立即用水冲洗镀铜镉粒，注意铜粒要始终用水浸没。当冲洗水中不再有铜沉淀时即可停止冲洗。
(6）在用于盛装镀铜镉粒的玻璃柱的底部装上几厘米高的玻璃纤维。在玻璃柱中灌入水，排净气泡。
(7)将镀铜镐粒尽快地装入玻璃柱，使其暴露于空气的时间尽量短。镀铜镉粒的高度应在15一20cm的范围内。
注1：避免在颗粒之间遗留空气。
注2：注意不能让液面低于镀铜镉粒的顶部。
(8)新制备柱的处理。将由750mL水、225mL硝酸钾标准溶液、20mL缓冲溶液和20mLEDTA溶液组成的混合液以不大于6mL/min的流量通过刚装好镉粒的玻璃柱，接着用50mL水以同样流速冲洗该柱。
4.2检查柱的还原能力
每天至少要进行两次，一般在开始时和一系列测定之后。
(1)用移液管将20mL的硝酸钾标准溶液移入还原柱顶部的储液杯中，再立即向该储液杯中添加5mL缓冲溶液。用一个100mL的容量瓶收集洗提液。洗提液的流量不应超过6mL/min
(2）在储液杯将要排空时，用约15mL水冲洗杯壁。冲洗水流尽后，再用15mL水重复冲洗。当第二次冲洗水也流尽后，将储液杯灌满水，并使其以最大流量流过柱子。
(3）当容量瓶中的洗提液接近100mL时，从柱子下取出容量瓶，用水定容至刻度，混合均匀。
(4）移取10mL洗提液于100mL容量瓶中，加水至60mL左右。然后按16.8.2和16.8.4操作。
(5)根据测得的吸光度，从标准曲线（10.3.4.8)上可查得稀释洗提液中的亚硝酸盐含量（μg/mL)。据此可计算出以百分率表示的柱还原能力（NO-的含量为0.067μg/mL时还原能力为100%)。如果还原能力小于95%，柱子就需要再生。
4.3柱子再生
柱子使用后，或锡柱的还原能力低于95％时，按如下步骤进行再生。
(1）在100mL水中加入约5mLEDTA溶液和2mL盐酸，以10mL/min左右的速度过柱。
(2)当储液杯中混合液排空后，按顺序用25mL水、25mL盐酸和25mL水冲洗柱子。
(3)检查镉柱的还原能力，如低于95%，要重复再生。
4.4样品的称取和溶解
(1）液体乳样品：量取90mL样品于500mL锥形瓶中，用22mL50一55℃的水分数次冲洗样品量筒，冲洗液倾入锥形瓶中，混匀。
(2）乳粉样品：在100mL烧杯中称取10g样品，准确至0.001g。用112mL50一55℃的水将样品洗入500mL锥形瓶中，混匀。
(3）乳清粉及以乳清粉为原料生产的粉状婴幼儿配方食品样品：在100mL烧杯中称取10g样品，准确至0.001g。用112mL50一55℃的水将样品洗入500mL锥形瓶中，混匀。用铝箔纸盖好锥形瓶口，将溶好的样品在沸水中煮15min,然后冷却至约5℃。
4.5脂肪和蛋白的去除
（1)按顺序加入24mL硫酸锌溶液、24mL亚铁氰化钾溶液和40mL缓冲溶液，加入时要边加边摇，每加完一种溶液都要充分摇匀。
(2)静置15min一1h。然后用滤纸过滤，滤液用250mL锥形瓶收集。
4.6硝酸盐还原为亚硝酸盐
(1)移取20mL滤液于100mL小烧杯中，加入5mL缓冲溶液，摇匀，倒入镉柱顶部的储液杯中，以小于6mL/min的流速过柱。洗提液（过柱后的液体）接入100mL容量瓶中。
(2）当储液杯快要排空时，用15mL水冲洗小烧杯，再倒入储液杯中。冲洗水流完后，再用15mL水重复一次。当第二次冲洗水快流尽时，将储液杯装满水，以最大流速过柱。
(3)当容量瓶中的洗提液接近100mL时，取出容量瓶，用水定容，混匀。
4.7测定
(1)分别移取20mL洗提液和20mL滤液于100mL容量瓶中，加水至约60mL。
(2)在每个容量瓶中先加入6mL显色液1，边加边混；再加入5mL显色液2。小心混合溶液，使其在室温下静置5min,避免直射阳光。
(3）加入2mL显色液3，小心混合，使其在室温下静置5min,避免直射阳光。用水定容至刻度，混匀。
(4）在15min内用538nm波长，以空白试验液体为对照测定上述样品溶液的吸光度。
4.8标准曲线的制作
(1）分别移取（或用滴定管放出）0mL、2mL、4mL、6mL、8mL、10mL、12mL、16mL和20mL亚硝酸钠标准溶液于9个100mL容量瓶中。在每个容量瓶中加水，使其体积约为60mLa
(2)在每个容量瓶中先加入6mL显色液1，边加边混；再加入5mL显色液2。小心混合溶液，使其在室温下静置5min,避免直射阳光。
(3）加入2mL显色液3，小心混合，使其在室温下静置5min,避免直射阳光。用水定容至刻度，混匀。
(4）在15min内，用538nm波长，以第一个溶液（不含亚硝酸钠）为对照测定另外八个溶液的吸光度。
(5)将测得的吸光度对亚硝酸根质量浓度作图。亚硝酸根的质量浓度可根据加入的亚硝酸钠标准溶液的量计算出。亚硝酸根的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标。亚硝酸根的质量浓度以μg/100mL表示。
五、分析结果的表述
5.1亚硝酸盐含量
样品中亚硝酸根含量按式（1)计算：
X=20000×c1/m×V1·······················(1)
式中：X—样品中亚硝酸根含量，mg/kg;
c1—根据滤液的吸光度，从标准曲线上读取的NO2-的浓度，μg/l00mL;
m—样品的质量（液体乳的样品质量为90×1.030g),g;
V1—所取滤液的体积，mL。
样品中以亚硝酸钠表示的亚硝酸盐含量，按式（2）计算：
W(NaNO2）=1.5×W(NO2-)············（2)
式中：W(NO2-)—样品中亚硝酸根的含量，mg/kg;
W(NaNO2)—样品中以亚硝酸钠表示的亚硝酸盐的含量，mg/kg,
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。
5.2硝酸盐含量
样品中硝酸根含量按式（3）计算：
式中;X一样品中硝酸根含量，mg/kg;
c2—根据洗提液的吸光度，从标准曲线上读取的亚硝酸根离子浓度，μg/l00mL;
m—样品的质量，g;
V2—所取洗提液的体积，mL;
W(NO2-)—根据式（1)计算出的亚硝酸根含量。
若考虑柱的还原能力，样品中硝酸根含量按式（4)计算：
样品的硝酸根含量=
式中：r—测定一系列样品后柱的还原能力。
样品中以硝酸钠计的硝酸盐的含量按式（5)计算：
W(NaNO3）=1.371x×W(NO3）············（5)
式中：W(NO2-)—样品中硝酸根的含量，mg/kg;
W(NaNO2)—样品中以硝酸钠计的硝酸盐的含量，mg/kg,。
以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字。
六、精密度
由同一分析人员在短时间间隔内测定的两个亚硝酸盐结果之间的差值，不应超过1mg/kg。
由同一分析人员在短时间间隔内测定的两个硝酸盐结果之间的差值，在硝酸盐含量小于30mg/kg时，不应超过3mg/kg;在硝酸盐含量大于30mg/kg时，不应超过结果平均值的10%。
由不同实验室的两个分析人员对同一样品测得的两个硝酸盐结果之差，在硝酸盐含量小于30mg/kg时，差值不应超过8mg/kg;在硝酸盐含量大于或等于30mg/kg时，该差值不应超过结果平均值的25%。
七、说明及注意事项
(1)本标准适用于食品中亚硝酸盐和硝酸盐的测定。
(2）本标准第一法中亚硝酸盐和硝酸盐检出限分别为0.2mg/kg和0.4mg/kg；第二法中亚硝酸盐和硝酸盐检出限分别为1mg/kg和1.4mg/kg;第三法中亚硝酸盐和硝酸盐检出限分别为0.2mg/kg和1.5mg/kg。