【求助】少突胶质前体细胞震荡分离后全部死了

我最近在培养少突胶质前体细胞遇到了一点困难，我的少突胶质前体细胞在原代混合培养第八天进行震荡分离，将培养瓶盖拧紧，用封口膜封口，放于37℃恒温振动摇床150 r/min，震摇1 h，吸出所有培养上清，再加入新鲜培养基以去除小胶质细胞等杂细胞。然后再将培养瓶盖拧紧，用封口膜封口，放于37℃恒温振动摇床以220 r/min速度振荡21 h，振荡结束后，在倒置显微镜下发现瓶壁上没有任何细胞了，看到的只是残渣碎片，然后又把瓶内的培养基用离心管离心，没看到有细胞沉淀，吸取底部液体用显微镜观察，也没看到有细胞成分。我想，细胞全部死了，连星形胶质细胞也死了。
基于以上，我想问几个问题：1.在摇床里，玻璃培养瓶的放置方式。是用竖立的放置还是平躺的方式？我的玻璃培养瓶在恒温震动摇床上是平躺放置的，也就是我们一般放在培养箱里的放置方式。2.玻璃培养瓶开始去除小胶质细胞之前是把培养瓶盖拧紧，封口膜封死。但在用恒温摇床以220 r/min速度振荡21 h之前，是不是也要把培养瓶口拧紧，然后用封口膜封死进行震荡？因为我的细胞经历了21小时的缺氧，我担心是因为封口膜封死后造成的。3.我的设置时间是21h，是不是太长了？部分文献里采用时间不等的摇床震荡时间，大约都是在20小时左右。