【求助】关于EcoRI和NotI的双酶切实验
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最近在做EcoRI和NotI的双酶切，pmd19t连接有目的基因（约170bp），基因两端是EcoRI和NotI位点。但是酶切没有发现条带。
具体酶切体系：
用的thermo的NotI和bufferO，NEB的EcoRI
NotI 0.2
EcoRI 0.2
10Xbuffer O 2
质粒（100ng/μl） 5
水 12.6
酶切3h；120v 30min 2.5%的胶
另外，看到一些帖子，做了先NotI酶切过夜（70度20分钟失活），后EcoRI酶切2小时，依然没有条带。
maker 是1kb ladder，因为小的maker刚好用完了，最下一条是1000bp。1-3是分步，4-5是双酶切，6是原质粒。末尾50bp maker但应该是放久降解了
希望大家给出意见啊。另外，之前博士后做过类似的，也经常没结果，后来用PCR出得产物直接切，结果不错。不过，我还是希望能直接切出来啊（这个质粒是交给公司合的）
最近在做EcoRI和NotI的双酶切，pmd19t连接有目的基因（约170bp），基因两端是EcoRI和NotI位点。但是酶切没有发现条带。
具体酶切体系：
用的thermo的NotI和bufferO，NEB的EcoRI
NotI 0.2
EcoRI 0.2
10Xbuffer O 2
质粒（100ng/μl） 5
水 12.6
酶切3h；120v 30min 2.5%的胶
另外，看到一些帖子，做了先NotI酶切过夜（70度20分钟失活），后EcoRI酶切2小时，依然没有条带。
maker 是1kb ladder，因为小的maker刚好用完了，最下一条是1000bp。1-3是分步，4-5是双酶切，6是原质粒。末尾50bp maker但应该是放久降解了
希望大家给出意见啊。另外，之前博士后做过类似的，也经常没结果，后来用PCR出得产物直接切，结果不错。不过，我还是希望能直接切出来啊（这个质粒是交给公司合的）
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