【求助】心肌细胞肥大造模
发布于 2014-04-10 · 浏览 1879 · IP 广东广东
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以下是我上次进行心肌细胞原代培养（SD乳鼠）及AngII处理试验的具体操作步骤，
2014-03-31
试验步骤：
1． 将所有试验器皿放入超净台，紫外线消毒灭菌30min；
2． 两块培养皿中加入D-Hanks液20ml待用（洗涤分离出的心脏组织）；
3． 三角瓶中加入不预热的含EDTA胰酶7.5ml（0.5ml/只）待用；
4． 烧杯中加入酒精适量：乳鼠消毒；
5． 将乳鼠浸入酒精中10s消毒
6． 左手持乳鼠，暴漏胸廓术野，食指按压乳鼠上肢，无名指按压乳鼠双下肢，中指位于乳鼠背侧；
7． 右手持剪刀于乳鼠剑突上一肋骨纵向剪切皮肤及皮下组织，然后做横切切断肋骨；
8． 左手挤压胸廓，可见心脏跳出到视野
9． 右手持镊子取出心脏置于备好的D-Hanks液体中
10． 重复上述过程取出所有乳鼠的心脏置入D-Hanks液洗涤两遍，双手持镊子将心脏撕裂
11． 置于含EDTA胰酶中，在4℃冰箱中过夜
2014-04-01
1. 称量40mg胶原酶、250mgBSA置于50ml离心管中
2. 在超净台上进行下列操作：加入D-hanks50ml配置胶原酶溶液，0.22μm滤器过滤除菌
3. 取出冰箱中的心肌组织，加入10%FBS不含Brdu的全培7.5ml（0.5ml/只），37℃水浴5分钟。----目的：中和胰酶；
4. 吸弃上清。
5. 加入胶原酶7.5ml（0.5ml/只），37℃水浴40s，绝对<1min！！！！！
6. 吸弃上清液，加入胶原酶9ml（0.6ml/只），震荡15分钟。
7. 在步骤6间歇，取50ml离心管中加入10% FBS不含Brdu全陪6ml（0.4ml/只），步骤6结束后将上清液移入预先备有10%FBS全培的50ml离心管中。
8. 反复进行步骤6直到完全消化心肌组织（大约重复2-3次）。
9. 吸取上清转移到备有全陪的50ml离心管中，离心：1000rpm，5分钟
10. 准备两块培养皿，各培养皿加入5ml 10%FBS全培；
11. 步骤9结束后，弃去上清，加入2ml全培，吹打混匀后各培养皿中加入1ml细胞悬液；
12. 置于37℃培养箱中培养90分钟；
13. 90分钟后，吸取培养皿上清，转移至50ml离心管中；培养皿中加入10ml全培，置于培养箱中继续培养（成纤维细胞）
14. 含心肌细胞的细胞悬液离心：1000 rpm，5分钟，37℃
15. 离心后弃去上清，加入3600μl全培，吹打混匀
16. 取6块6孔板，每孔预先加入2400μl全培养基（10%FBS含Brdu）；然后每孔中加入100μl心肌细胞悬液；
17. 注明姓名、日期、编号（如下），置于培养箱中培养
AngII处理过程
2014-4-2心肌细胞换液
操作步骤
1. 超净台UV消毒30分钟；
2. 预热10%FBS全培（含Brdu）--需要量36*2ml=72ml、PBS
3. 取出细胞培养板，贴壁注入PBS，PBS洗涤2遍，每孔加入2ml全培养基；
4. 放入培养箱中培养
2014-4-3心肌细胞换液
1. 超净台UV消毒30分钟；
2. 预热10%FBS全培（不含Brdu）--需要量36*2ml=72ml、PBS
3. 取出细胞培养板，贴壁注入PBS，PBS洗涤2遍，每孔加入2ml全培养基；
4. 放入培养箱中培养
2014-4-4饥饿心肌细胞
5. 超净台UV消毒30分钟；
6. 预热不含FBS的DMEM（不含Brdu）--需要量36*2ml=72ml、PBS
7. 取出细胞培养板，贴壁注入PBS，PBS洗涤2遍，每孔加入2mlDMEM；
8. 放入培养箱中培养
2014-4-5药物处理
处理药物：AngII
处理浓度：AngII：10-5mol/L和10-6mol/L两个浓度；
计划处理列表
AngII处理48h
A1/A3：A_ACon
AngII处理48h
AngII处理细胞48h后，提取总RNA
逆转录行qPCR检测肥大基因ANP/α-MHC mRNA表达
结果在AngII组和对照组之间表达没有差异啊
请教各位大虾，给小弟提点儿意见，为啥如此成熟的一个心肌肥大模型，在我这儿怎么这么困难啊。
跪求赐教啊。我这儿都折腾了1个多月了，焦虑万分啊
2014-03-31
试验步骤：
1． 将所有试验器皿放入超净台，紫外线消毒灭菌30min；
2． 两块培养皿中加入D-Hanks液20ml待用（洗涤分离出的心脏组织）；
3． 三角瓶中加入不预热的含EDTA胰酶7.5ml（0.5ml/只）待用；
4． 烧杯中加入酒精适量：乳鼠消毒；
5． 将乳鼠浸入酒精中10s消毒
6． 左手持乳鼠，暴漏胸廓术野，食指按压乳鼠上肢，无名指按压乳鼠双下肢，中指位于乳鼠背侧；
7． 右手持剪刀于乳鼠剑突上一肋骨纵向剪切皮肤及皮下组织，然后做横切切断肋骨；
8． 左手挤压胸廓，可见心脏跳出到视野
9． 右手持镊子取出心脏置于备好的D-Hanks液体中
10． 重复上述过程取出所有乳鼠的心脏置入D-Hanks液洗涤两遍，双手持镊子将心脏撕裂
11． 置于含EDTA胰酶中，在4℃冰箱中过夜
2014-04-01
1. 称量40mg胶原酶、250mgBSA置于50ml离心管中
2. 在超净台上进行下列操作：加入D-hanks50ml配置胶原酶溶液，0.22μm滤器过滤除菌
3. 取出冰箱中的心肌组织，加入10%FBS不含Brdu的全培7.5ml（0.5ml/只），37℃水浴5分钟。----目的：中和胰酶；
4. 吸弃上清。
5. 加入胶原酶7.5ml（0.5ml/只），37℃水浴40s，绝对<1min！！！！！
6. 吸弃上清液，加入胶原酶9ml（0.6ml/只），震荡15分钟。
7. 在步骤6间歇，取50ml离心管中加入10% FBS不含Brdu全陪6ml（0.4ml/只），步骤6结束后将上清液移入预先备有10%FBS全培的50ml离心管中。
8. 反复进行步骤6直到完全消化心肌组织（大约重复2-3次）。
9. 吸取上清转移到备有全陪的50ml离心管中，离心：1000rpm，5分钟
10. 准备两块培养皿，各培养皿加入5ml 10%FBS全培；
11. 步骤9结束后，弃去上清，加入2ml全培，吹打混匀后各培养皿中加入1ml细胞悬液；
12. 置于37℃培养箱中培养90分钟；
13. 90分钟后，吸取培养皿上清，转移至50ml离心管中；培养皿中加入10ml全培，置于培养箱中继续培养（成纤维细胞）
14. 含心肌细胞的细胞悬液离心：1000 rpm，5分钟，37℃
15. 离心后弃去上清，加入3600μl全培，吹打混匀
16. 取6块6孔板，每孔预先加入2400μl全培养基（10%FBS含Brdu）；然后每孔中加入100μl心肌细胞悬液；
17. 注明姓名、日期、编号（如下），置于培养箱中培养
AngII处理过程
2014-4-2心肌细胞换液
操作步骤
1. 超净台UV消毒30分钟；
2. 预热10%FBS全培（含Brdu）--需要量36*2ml=72ml、PBS
3. 取出细胞培养板，贴壁注入PBS，PBS洗涤2遍，每孔加入2ml全培养基；
4. 放入培养箱中培养
2014-4-3心肌细胞换液
1. 超净台UV消毒30分钟；
2. 预热10%FBS全培（不含Brdu）--需要量36*2ml=72ml、PBS
3. 取出细胞培养板，贴壁注入PBS，PBS洗涤2遍，每孔加入2ml全培养基；
4. 放入培养箱中培养
2014-4-4饥饿心肌细胞
5. 超净台UV消毒30分钟；
6. 预热不含FBS的DMEM（不含Brdu）--需要量36*2ml=72ml、PBS
7. 取出细胞培养板，贴壁注入PBS，PBS洗涤2遍，每孔加入2mlDMEM；
8. 放入培养箱中培养
2014-4-5药物处理
处理药物：AngII
处理浓度：AngII：10-5mol/L和10-6mol/L两个浓度；
计划处理列表
AngII处理48h
| A1=Ang II 10-5mol/L | A2= Ang II 10-5mol/L | A3=Con |
| A4= Ang II 10-5mol/L | A5= Ang II 10-5mol/L | A6=Con |
AngII处理48h
| B1= Ang II 10-6mol/L | B2= Ang II 10-6mol/L | B3=Con |
| B4= Ang II 10-6mol/L | B5= Ang II 10-6mol/L | B6=Con |
AngII处理细胞48h后，提取总RNA
逆转录行qPCR检测肥大基因ANP/α-MHC mRNA表达
结果在AngII组和对照组之间表达没有差异啊
请教各位大虾，给小弟提点儿意见，为啥如此成熟的一个心肌肥大模型，在我这儿怎么这么困难啊。
跪求赐教啊。我这儿都折腾了1个多月了，焦虑万分啊
最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1879
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