关于His-tag融合蛋白质的纯化问题

在下styang，初来乍到，还请各位大虾多多关照。看到好几个贴子谈到His-tag的纯化问题，我想说说自己的体会。先说结论，我认为His-tag不是一个很好的tag，因为6-His这样的氨基酸序列的特异性比较差，用TALON或者Ni来提纯的时候很难得到比较好的结果，所以建议用其它的tag，例如HA,FLAG或者HSV。His-tag纯化的基本理论简单的说就是想让His跟树脂结合，然后再用wash buffer把其他不能跟树脂结合的蛋白质洗脱，然后用elution buffer将His-tag蛋白洗脱。在wash buffer以及elution buffer里面，imidazole的浓度非常关键，在正式大量精制以前，要尽可能多的试用各种条件。例如，wash buffer里面加入或者不加入5mM imidazole,加入或者不加入1% triton x-100。另外，elution bufferl里面的imidazole在什么样的浓度下能最大限度提高目的蛋白质浓度/其它蛋白质的比率，应该进行更详细的条件实验，例如10mM,20mM一直到100mM，然后是200mM,300mM,400mM,500mM,600mM，然后是EDTA，每种浓度进行4个bead volume的溶出，然后SDS-PAGE,CBB染色，看看那个浓度最好。假设40mM和50mM之间能得到一个比较好的结果，那就进一步，imidazole 40mM,42mM,44mM,46mM,48mM，50mM来进行elution实验。总之，elution里面imidazole的浓度预实验应该做的细。