【进展】神经元特异性烯醇化酶研究进展

神经元特异性烯醇化酶研究进展

摘要 神经元特异性烯醇化酶(NSE)是近年来逐渐被临床所重视的存在于脑组织中的酸性可溶性蛋白。随着研究的进展，它在肿瘤，神经系统等的特殊作用被大量地发现，甚至可以进行脑损伤范围的定量分析。因此，相关于它的研究也越来越多。本文就NSE近年来的研究进展作一综述

关键词 神经元特异性烯醇化酶 基础研究 临床研究

背景目前在脑外伤(traumatic brain injury,TBI)的诊断中，主要依靠神经学检查，CT,MRI等影像学资料，实验室诊断尚未普及。 而众所周知，在许多神经系统疾病的病理过程中，随着神经元、胶质细胞的坏死，神经髓鞘的崩解，以及血脑屏障的破坏，正常存在于细胞内的许多蛋白酶分子可以释放进人血液和脑脊液中。通过监测脑组织损伤后，这些蛋白酶分子在血液和脑脊液中含量的变化，可以了解脑损伤的严重程度和病情发展趋势。在临床实践中，为 诊断病情，评价预后，指导治疗提供有实用价值的实验室诊断依据。

1965年,Moore和McGregor首次发现了一种大量存在于脑组织中而不存在于非神经组织中的酸性可溶性蛋白,称之为14-3-2蛋白。后来人们发现该蛋白特征性地位于神经元中,并具有烯醇化酶活性,故将其命名为神经元特异性烯醇化酶(NSE)。近20年来,NSE作为敏感的肿瘤标志物以及脑损伤时的定量指标正逐渐被临床所重视。

1 基础研究
1.1 NSE的分子结构及生化特征 烯醇化酶(2-磷酸-D-甘油酸酯氢化酶)是糖酵解过程中催化2-磷酸甘油酸脱水生成磷酸烯醇式丙酮酸的关键酶。由三种免疫原性的α、β、γ亚基组成了五种二聚体同工酶:αα、ββ、γγ、αβ、αγ。脑组织内γγ数量最多,即NSE,占中枢神经系统中可溶性蛋白的1.5%。γ亚基由433个氨基酸组成,通过非共价键构成NSE。目前NSE的氨基酸序列及其基因序列已为人们所探知。γ亚基的三维结构包括大约130个氨基酸的N端区域及大约300个氨基酸的8个α/β管状结构,其中β链位于管状结构的核心部位,为NSE的活性位点所在,周围环绕α螺旋。主要的活性位点有组氨酸-189、精氨酸-371和赖氨酸-393。NSE所有抗原决定簇都分布在48～96、188～293、399～433氨基酸序列区,位于其三维结构表面,在免疫反应中可刺激机体产生NSE的单克隆抗体,可用于NSE的检测[1]。NSE相对分子质量约为78000,等电点为pH4.7。与αα同工酶相比,NSE在Cl-、尿素及50℃的条件下更稳定。在反复去极化的情况下,神经细胞内的Cl-会逐渐增多,NSE对Cl-诱导的灭活作用不敏感,则可保证糖酵解的正常进行,提供足够的代谢所需要的能量[2]。
1.2 体内分布 NSE分布于全身各个系统，绝大部分分布于中枢神经系统中，其他主要脏器及血清水平不足CNS的1％，神经系统中分布顺序为:大脑>脊髓>外周神经系统。 正常情况下，NSE主要分布于神经元和脱羧细胞（APUD）系统细胞，也分布于红细胞、血小板、淋巴细胞及反应性胶质细胞，而肿瘤状态下则存在于几乎所有类型的脑肿瘤中。细胞内N SE的分布，光镜下免疫组化染色可见NSE存在于正常神经元的胞体、轴突和树突，电镜下还可见NSE分布于肿瘤细胞的膜性结构如胞膜、核膜和线粒体等，胶质瘤中还分布于胞浆丝状结构中。
但是，倘若神经元受到损伤,则NSE在细胞内的分布会有所变化。当切断在体面神经及舌下神经,行面面、舌下-舌下或面-舌下神经吻合时,免疫组化研究发现,R1神经元及仅表现核质NSE免疫活性的R2神经元明显增多,最高可分别达60%及29%,这可能源于在缺血-缺氧状态下神经元存活需要NSE提供大量ATP以满足核酸合成,以及NSE的间接产物丙酮酸能够保护胞核免受过氧化物损害,二者作用的结果导致胞质内NSE暂时迁移至细胞核,以后这种现象可逐渐在几个月内恢复[3]。倘若神经元发生坏死,则NSE会漏至细胞外间隙致使体液中增高。
1.3 NSE的测定 NSE的测定分定量测定、半定量及定性测定两方面:
定量测定:利用放射免疫法和酶免疫法测定液体，包括CSF、血清和组织提取液如肿瘤组织提取液中NSE的含量匡[4，5，6] 。
半定量及定性测定:利用免疫组织化学方法定性研究组织切片中NSE的分布特征，或半定量研究组织切片中NSE的水平，方法有亲和素—生物素复合物法(ABC法)及过氧化物酶抗过氧化物酶法(PAP)法[7，8，9]
目前单克隆抗体的应用提高了NSE在诊断上的特异性，电镜文将NSE的研究带入了超微结构领域，由于这些技术的发展，NSE临床研究的价值必将得到提高仁[7 ] 。
1.4　影响NSE检测结果的因素 据观察体液NSE水平与性别、高胆红素血症、高脂血症无显著的相关性。
1.4.1　溶血　红细胞及血小板内均含一定量的NSE,有人发现即使只有2%的溶血,NSE浓度也会明显升高(基础值为4.0ng/ml,发生2%溶血后>20ng/ml)。因此,在实验过程中应严格避免溶血,以免发生错误结果。未冰冻的血清NSE浓度亦会有所下降 [10]　。
1.4.2　年龄　正常人血清NSE水平与年龄无关。但脑脊液NSE可能与年龄呈正相关,每增长1岁,NSE升高0.1%～1.4%,平均每年增加1%。其机制可能为:1随年龄增长,缺血的神经元增多,NSE释放增加;2随年龄增长,成熟的神经元增多,其内NSE含量亦增多,细胞代谢时则NSE释放增加;3随年龄增长,脑脊液循环总量逐渐下降,则脑脊液内蛋白浓度相应增高,NSE含量亦可能增高。
1.5病理研究 不同疾病所致神经损伤其NSE峰值出现的时间不同，这与其病理过程有关.
Hardemark等通过对实验性脑创伤和局灶性脑缺血大鼠模型的研究发现，脑外伤后脑脊液中NSE有两个峰值，第一个峰值出现于伤后1. 5h，然后很快降至正常，约在伤后1. 5d出现第二个峰，其水平较第一个峰值小[11]。在局灶性脑缺血时，NSE峰值出现较晚，约在缺血发生后2-4d。有学者认为，外伤后第一个峰值反映了神经细胞的原发损伤，系神经细胞瞬间发生的机械性破裂，细胞内大量蛋白质以一种“蛋白波”在短时内进人脑脊液，而第二个峰值则是由于继发性损害所致，外伤后局部组织血流减少产生缺血缺氧改变[13]。局灶性脑缺血时NSE峰值出现较晚，其可能的解释是脑缺血损伤相对于脑外伤是一种渐进的过程，神经细胞在脑缺血后数天内可能连续死亡。Schaarschmidt等报道一脑梗塞患者血中脑脊液NSE出现三个峰值[13]，与Hardemark的结果相似，但血中出现峰值时间要比脑脊液晚。

2 临床研究
2.1癫痈 癫痈发作本身是否引起脑损伤存在较大争议。动物模型表明，用海人酸或电刺激诱发癫痈后发作的易感性增加，但人类单次全身强直—阵挛发作(GTCS)是否引起脑损伤尚未明了，也就是因为缺乏象心肌梗塞后肌酶学一样的客观定量指标[14]。Rabinowicz等[15]研究了25例住院病人(15例癫痈,10例非癫痈)在连续录相EEG监测下血清NSE变化，选择出现第一次临床发作做为研究终点。癫痈组血清NSE发作后值显著高于其基础值及正常对照组值，特别是4例继发性GTCS病人增高明显，增加值近似于无急性神经系统损伤的癫痫持续状态病人;非癫痈组NSE无明显升高。可见癫痫发作引起脑损伤。值得注意的是9例复杂部分性发作(CPS)中有4例NSE与基础值相比无变化甚至降低。这提示NSE变化反映了癫痛病灶的范围及受累解剖结构的特殊易损性。该作者接着还研究了癫痈样放电后NSE的变化， 3例癫痈手术病人在皮层EEG监测下注射甲黑西塔耳(Methohexital，一种很强的痫性放电激活物)前后脑脊液与血清NSE水平，发现甲黑西塔耳激活后皮层EEG呈现痛性放增多，脑脊液NSE很快升高达基础值3一4倍，而血清NSE在60分钟后仍无明显变化，遂认为脑脊液NSE是比血清NSE更好的痫性活动标志，提示痫性放电可以引起一过性脑损伤。其他研究还发现无热惊厥儿童血清NSE水平明显高于单次非复杂性发热惊厥儿童，频繁发作和难治性病人也有较高的NSE值。脑梗塞动物模型研究[16]发现，脑脊液NSE变化与脑梗塞时间及范围有关，小的梗塞或短暂脑缺血发作不会引起NSE升高，从而推测NSE可用来判断引起脑损伤所需的痫性发作时间及估计预后。[17]
2.2 急性脑外伤 SkogseidE[18]研究发现，60例脑外伤病人80%血清NSE升高，比CT阳性率(40％)高，其最大值与病情严重程度及CT显示的脑挫伤体积相关.Yamazaki[19]对25例急性脑外伤的研究结果亦有类似发现，死亡病人的血清NSE和髓鞘碱性蛋白(MBP)明显高于存活病人，存活病人的颈静脉血NSE和M BP分别为17.6士11.4ng/ml和1.4士1.5ng/ml，而死亡病人增至51.3士27.3ng/ml和11.3士9. 5ng/ml，结果表明，血清NSE和MBP水平测定为脑损伤程度的判断提供了一个可靠的实验室指标，并可用于预测急性脑外伤病人的预后
2.3 脑血管疾病 在多种脑血管疾病中,NSE是反映脑损害的一个定量指标｡实验与临床研究均证明,脑梗塞灶的大小与脑脊液中NSE的水平有关,梗塞面积大,则CSF中NSE水平高[20]｡在脑出血中,NSE值与入院时的意识水平､预后无明显相关,但与血肿大小密切相关,血肿直径大于5cm者,NSE值比小血肿有明显升高｡对SAH病人,CT扫描显示达Fisher3～4级比Fisher2级者NSE值高｡如果发生脑血管痉挛,NSE水平在5~15天内持续升高[21]｡在缺氧性脑卒中病人,如NSE值大于120ng/ml,均致死亡,幸存者NSE值均小于100mg/ml,NSE值正常者神经功能完全恢复[22]｡在脑血管疾病中,NSE升高见于3个不同时期,最早在发病后数小时,反映最初的脑损害;第2次发生于24~72小时,常预示临床恶化;第3次在48小时~数天后,为水肿或颅内压增高引起的继发性神经元损伤｡后两次的NSE升高常预示临床恶化,提示预后不良｡在缺血性脑病中,NSE的升高早于临床状况的恶化[22]｡在随访中发现,后遗有多灶性梗塞的痴呆病人发病初期NSE水平即高于无后遗症的病人｡因此,NSE可做为预后判断指标之一｡而在痴呆病人中,NSE的测定没有太大的诊断价值[23]｡另外在实验中发现,对大脑中动脉闭塞(MA CO)的大鼠,给于脑保护剂MK 801治疗,NSE水平随病情改善而有所减低,NSE可成为评价脑卒中后脑保护剂治疗效果的一个辅助手段[20]｡
2.4 新生儿缺血缺氧性脑病 新生儿窒息致脑损害新生儿窒息引起的缺氧性脑损害的早期和准确的判断是一个困难的问题,虽有脑电图､神经放射､脑血流检查等,生化学指标是评价脑损害的可靠指标｡有人对69例有窒息的新生儿,分别于出生后12､72小时腰穿取脑脊液测定NSE值｡49例有不同程度脑病的,NSE水平均有增高,昏迷或死亡病儿中,NSE值最高｡NSE值升高与妊娠方式､Apgar评分､动脉血pH均无关系｡有意义的是,对一年后的病情转归进行比较,发现后遗有脑性瘫痪的儿童,当时的NSE值即明显高于无神经损害或轻度损害的儿童,并以出生后12小时的NSE值最可靠｡而国内的类似研究也得到了相同结果[24]。所以,NSE有助于确定婴儿有无发生神经和发育后遗症的危险。
2.5 Alzheirer病(AD)和血管性痴呆(VD) 目前AD所致的痴呆尚无有效的治疗方法,VD常可因血管病变的预防和治疗而延缓痴呆的进程,因此二者的早期鉴别诊断甚为重要｡目前二者的鉴别主要依靠临床表现和CT､MRI所见,没有可靠的生化指标｡最近不少作者试图通过测定CSF､NSE水平来协助二者的诊断,但结果并不令人满意｡Blennow等[25]对45例AD､19例VD和45例正常人的血清和CSF､NSE水平进行了测定,CSF､NSE含量AD组为4 7±2 7ng/ml､VD组为4 5±2 5ng/ml,均明显高于对照组(2 2±1 0ng/ml,P<0 001),而AD和VD二组间无明显差异;血清NSE与CSF不相关;认为CSF､NSE对痴呆的鉴别诊断缺乏特异性｡随后,Parnetti等[26]的研究发现,AD组CSF､NSE水平与对照组无明显差异,但NSE水平和认知功能缺损程度呈正相关;VD组CSF､NSE水平较AD组和对照组明显降低;这一发现尽管有一定意义,但一般认为CSF､NSE仍不能作为痴呆鉴别的诊断指标｡
2.6 Creutzfeldt-Jakob病(CJD) CJD是人类最常见的由人朊病毒引起的人畜共患病,Nevin等1960年命名为急性海绵状脑病｡[27]临床诊断CJD主要依据两三年内迅速进展的痴呆､典型的神经系统体征和EEG上出现周期性尖慢复合波,实验室检查仅发现50%的患者CSF蛋白轻度增加,缺乏诊断意义｡最近,Zerr[28]报告CSF､NSE浓度增高可作为本病的诊断指标之一｡作者对58例CJD确诊病例､46例可能病例､34例可疑病例和43例其它病例CSF､NSE水平进行了检测,以35ng/ml作为临界值(正常对照组平均为9 5ng/ml),四组病例NSE阳性率分别为79%､80%､59%和9%｡CSF､NSE测定对CJD的诊断敏感度为80%,特异性为92%｡
2.7 精神分裂症 近年来的研究发现某些精神分裂症患者表现有大脑结构异常,主要包括第三脑室和侧脑室扩大及颞叶体积减小,并认为是脑发育异常或神经变性的结果｡推测本病与NSE可能有一定关系｡Burbaeva[29]研究了15例健康对照者和9例精神分裂症患者尸脑不同部位NSE和NNE的浓度,发现本病患者感觉皮层的NSE浓度增加70%,丘脑减少70%,颞叶皮层和海马减少15%~20%,NNE浓度各部位无明显差异,作者认为感觉皮层和丘脑NSE浓度的显著变化与精神分裂症的发生和病理发展过程密切相关｡进一步的研究发现,精神分裂症患者血清和CSF､NSE水平与正常对照组无明显差异,不支持上述结论[30]｡因此NSE测定在精神分裂症中的意义尚难肯定,有待进一步研究｡
结语
综上所述，NSE已经成为神经系统相关研究的一个热点。近年来，这方面的研究也进展迅速。因此，临床上有可能通过对NSE的动态监测作出疾病病情估计和预后判断。NSE对神经元损伤的的诊断、病变范围及治疗效果的评估、预后判断均有一定的价值,有望成为临床监测脑损伤的重要指标。目前,对NSE的研究还需要扩大样本、增加病种,方能得出真实可靠的结论。