【求助】PHA刺激PBMC增殖，细胞数不增反降，请大家帮忙！

试验中加入PHA后，PBMC数量不增反降，且随PHA浓度增加而数量随之减少，呈反比趋势；细胞团块数量和大小随PHA浓度增加而增加；死细胞数量也岁PHA浓度增加而增加。
考虑1：是否是PHA引起了红细胞凝集。那些细胞团块，是增殖团块吗？如果是，为何细胞数量会减少？那些细胞团块如果是红细胞聚集，为何细胞体积会比正常细胞大的多？


考虑2：是否是PHA引起了PBMC死亡。如果是，为何PHA不引起增殖反而引起死亡，低浓度（5ug/ML）情况下也是这样？
或者是其他什么原因，试验中是否存在什么问题？
请各位帮忙分析一下，不胜感激！


一 试剂

1培养基：RPMI1640(HYCLONE 含谷氨酰胺 不含HEPES)。配制时加入10mM/L的HEPES，碳酸氢钠。加入1mM/L的丙酮酸盐。加入5×10E-5M/L的β巯基乙醇。加入青霉素、链霉素、两性霉素。 加入10%胎牛血清（GIBCO）未灭活。
2 刺激物：PHA-P (5mg装 SIGMA)。使用终浓度为0ug/ml、5ug/ml、10ug/ml、20ug/ml、40ug/ml
二分组
分为5组。用平底24孔板。细胞密度1×10E6/ml。每孔1ml。
其中，PBMC分离过程未使用红细胞裂解液，分离出来以后杂有少量红细胞
1 PBMC+0ug/ml PHA:
2 PBMC+5ug/ml PHA;
3 PBMC+10ug/ml PHA;
4 PBMC+20ug/ml PHA
5 PBMC+40ug/ml PHA
三 结果
第48h和72h分别台盼蓝染色计数，趋势是一致的。以下为72h时候的细胞数量及形态
1 PBMC+0ug/ml PHA:
细胞数量48h、72h仍约100×10E4/ml 即细胞数量无甚变化
台盼蓝染色几无死细胞
形态无甚变化（下图为20倍镜下）

2 PBMC+5ugPHA
细胞数量：约85×10E4 即数量减少
台盼蓝染色：几无死细胞
形态：可见零星小的细胞团块

3 PBMC+10ug/mlPHA
细胞计数：80×10E6 即细胞数量进一步减少
台盼蓝染色：可见零星蓝染死细胞
形态：细胞团块较上组变大，变多。一个视野下约有6—8个左右团块，团块的细胞体积较大。

4 PBMC+20ugPHA
细胞数量：75×10E4 即细胞数量较上一组又有减少
台盼蓝染色：蓝染死细胞数较上一组增多
细胞形态：细胞团块数目更多，体积更大，一个视野下约有十个左右团块。但是视野下的非团块的细胞较上一组明显稀疏。

5 PBMC+40ug/mlPHA
细胞数量：50×10E4 即较上一组又有所减少，几组里面数量最少
台盼蓝染色：蓝染的死细胞数量明显增多，几组里面死细胞最多
形态：细胞团块最大，数量最多。非团块的细胞已经非常稀疏。