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【求助】关于扩增曲线和溶解曲线,求大神解释,一直困扰我的两个问题

发布于 2012-06-05 · 浏览 1707 · IP 上海上海
这个帖子发布于 12 年零 352 天前,其中的信息可能已发生改变或有所发展。
背景:体系比较独特,也许就是问题的根源吧。
废话不说先
模板:小鼠尾gDNA 200ng/2ul
酶:天根taq PCR masterMix(普通酶,不含荧光染料) 10ul
染料:Eva Green(一种类似SYBR I的染料) 1ul
引物:目的/内参 5uM/1ul
刀刀水 6ul total 20ul
条件:90℃ 30s 1cycle;90℃ 30s,60℃ 30s,72℃30s,35cycles,melt curve, Default
PCR管:Bioplastics96孔板 仪器:ABI7500
体系配置流程:先依次加gDNA模板,然后将剩余组分预先混匀,再依次每孔加18ul预混液。
加样流程:gDNA模板全部加完后,依次加入两种预混液(分别含不同引物)。一般上下两排作为目的/内参一组,即是加完第一排目的基因的预混液,然后第二排加内参基因的预混液,后面依次轮流。PCR开始前离心5min去除气泡。

问题来了,
问题一:大部分孔起峰早,导致Ct值很低;详情见图

img

(A图是所用孔的扩增曲线,B、C、D分别是第1和2、3和4、5和6排的扩增曲线)
问题详细:由图中可见大部分孔第二个循环就起峰,信号一直持续而且相当高,对Ct值得影响相当大。不是知否PCR体系的原因导致,还是其他,求各位大神指点。

问题二:同样是扩增曲线的问题,一般情况是目的/内参两个基因的阈值大致相等,而我的却相差很多,这一现象是否也是由起峰早引起的?见下图

img

起峰早严重影响了Ct值得大小,使得结果无法判断,请大神们指点迷津。

问题三:关于溶解曲线,虽然目前看来不影响结果判断,但也想把原因搞清楚。
如图:
img

问题详细:由图可见,先加预混液的第1、第2排的溶解曲线明显没有后加的(3、4排)高。而且每次都是第1排最低,其次是第2排,而第3排和第4排高度又差不多了。目的基因和内参基因都是如此。
想请教峰的高低表示pcr扩增后的产量吗?(这个问题比较小白)是否加样顺序影响了峰的高低?大神们有没有遇到这种情况?

PS:问题有点长,谢谢大家耐心看完!欢迎提出宝贵意见!





























最后编辑于 2022-10-09 · 浏览 1707

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