【方法经验】神经组织学经验1-神经组织高尔基染色

想试着写个系列，把用过的组织学方法都说一遍，都是管见，大家可以补充，这次先说Golgi staining.
说起高尔基染色，那可是鼎鼎有名，公认的最传统和有效的神经系统形态研究的方法，到目前为止还没有其他的方法可以完全替代，诺奖得主的方法嘛，虽然经过很多人完善，但是精髓是不变的，都是用重金属盐染神经元树突和小突触棘，通过比较，基本可以看出神经发育，死亡，传递等方面的区别。通俗地说，树突范围小，发育就差，突触棘短，少，说明发育差，神经传递慢。
传统方法现在应用比较多的当属golgi-cox方法，但是过程繁琐，并且需要振动切片机，所以现在大家都是买试剂盒，用冰冻切片机来切片，应用试剂盒，可靠性也好，从发文章的角度，当然可靠性是最重要的。
我们用试剂盒做，过程还是比较简单的，但是有一些技巧还是值得分享一下的，下面就把大致过程理一遍。
1. 说明书里说溶液1和2需要提前一天混合，然后取上清液用，实践证明是必要的，如果直接混用，也会有结果但有难看的背景。
2. 动物不能灌注，（灌注会造成阴性结果）直接处死取脑，水洗一下，放入1，2混合液，（24小时换液），避光，室温14天（这个时间很重要，超过太长就会有难看的背景，有学生不小心，一下放了一个月，废了一批组织，把孩子吓得不轻）。
3. 14天后，把组织小心移入溶液3，避光，4度（室温好像也没什么区别），12到24小时换液，然后2到7天，这个时间稍长好像问题不大。
4. 组织用纸沾干，稍裹一些OCT，在用干冰降温的-70度异戊烷里冻硬，铝纸包好，负80度存放， 后来我们就直接把组织扔到负80度冰箱里冻硬，结果也很好。
5. 用OCT 或水把组织包埋到切片机托上，切片机设定-19度，厚度80到200微米都可以，我们用120，使用胶原处理的载玻片gelatin coated slides，表面涂一薄层溶液3，用毛笔把切片移到玻片上，小心导出气泡，斜放片子，避光晾干 24小时。--这一步根据我们出现的一些问题，要说明一下，片子干后要尽快做下一步，放的时间长（我们是10天）就会有难看的背景，这个说明里写了，我们没注意，结果杯具了。
6. 把片子过两遍水，溶液4和5，各5毫升，再加15毫升水，把片子放进混合液，盖紧，等10到15分钟，片子再过两遍水，然后50，75， 95，100%酒精系列脱水，二甲苯透明，树胶二甲苯封片，封片用的树胶最好要高浓度的，避免气泡，室温晾干，镜下观察。
7. 拍片和分析： 因为景深太小，所以高倍镜下不可能看到全部范围的树突，所以需要使用一些技术和方法, 最传统的叫camera lucida tracking，显微镜上接一个镜子，手转焦距旋钮，纸上的画像和眼里的显微镜图像重合，画下来就行了，然后用软件例如IPP分析。现在有x-y-z 轴的显微镜，可以用软件追踪画图，并直接给出分析结果，但这样的系统一般都奇贵无比，而且不怎么实用。
上几张照片，前两张是大体照片，最后两张可看到突触棘

关于使用的试剂盒，我们用的是 Hito Golgi-Cox OptimStain Kit，托人从米国带回来，打折后加运费大概450刀，可以做大概50个小鼠脑。切片很容易，因为温度好控制，基本上19度就可以了，有时候到了15，6度还勉强能切。刚开始因为没听说过不太敢买，就先订了一个免费试用装，能做两个小鼠脑，发现效果满意才正式下的订单。这是那个公司的网站 www.hitobiotec.com 有中文客服，我们电邮留一个电话号约个时间，基本都会打过来聊一聊。注册一个账户拿到一个9折券，一个8折券，都用了，不过这家公司好像不给私人地址寄，从费城寄到北京要花190多刀，太TM贵（现在据说联邦快递要两百多了）只好寄到朋友的实验室，只花了40多刀，再托人带回来，另一次是朋友从费城到纽约飞北京，就要求直接送到费城机场，免了邮费还是挺爽的。不好的一点就是没有中文说明书，学生没干过的有时会不太明白，有时就会浪费试剂和组织，问公司说是还在做，都两个月了，不知道做好没有。