【求助】用SW105做BAC的同源重组怎么就没有阳性克隆呢
1.先将BAC 电转到SW105里面,带Cm抗性,菌液PCR,酶切鉴定均正确
2.PCR扩增这个3.8K 的片段,主要是为了加上同源臂,两段同源臂各长80bp。PCR产物回收后大小正确,酶切鉴定正确,再用DpnI处理过夜后回收。回收产物酶切鉴定正确。
3.摇含BAC 的SW105 100ml,OD=0.4后取出,42°C热击15min诱导重组酶,然后冰浴开始做感受态。
4.做好后取100ul感受态加8ul 片段,冰浴几分钟之后电转,效率一般为4.9——5.0,然后加无抗培养基摇 1h 后涂 SPC 板,12h以内长出单菌落。
问题:
1.在SPC板上 12h以内就可以长起来,但做菌液PCR 无阳性结果,提BAC 酶切鉴定也无阳性结果。开始以为是抗性平板失效了,用重组前的SW105划了一块SPC板,过夜了也没有长起来,板子应该没有问题。
2.从SPC板上长的单菌落挑到SPC 液体LB 中用EP管摇的话也能长起来,但如果从EP管转接到试管就长不起来了,这是为什么?