抛砖引玉：PCR鉴定亚克隆出现假阳性的一个解释
这个帖子发布于 20 年零 256 天前，其中的信息可能已发生改变或有所发展。
最近作亚克隆，因为手里有目标条带的引物，图省事，用pcr鉴定。我的方法是，用*头将克隆的部分菌挑到PCR管中，用insert两端的引物扩之，如果出现期望的条带则认为该克隆是阳性，继续挑剩余的菌到LB中培养。
但在我PCR的7个克隆全出现了预期的条带，只是有一个的条带特别亮，其余6个都很暗。不太放心，重新要LB小提酶切鉴定，结果是只有那个PCR条带比较亮的为阳性。
和师兄们讨论的时候考虑的因素有质粒丢失，体系污染等等。我的一个解释是，由于转化感受态细胞的连接产物中含有insert片段，即存在模板，接下来涂平板的时候模版insert会分布到整个平板上，挑克隆到PCR体系中的时候不可避免的接触到平板，然后将模板带入其中，而模板的量实在太少，故只能扩出一条很暗的条带。
我想这一定是一个老问题，不知道其他的朋友怎么解释以及避免这种情况出现
但在我PCR的7个克隆全出现了预期的条带，只是有一个的条带特别亮，其余6个都很暗。不太放心，重新要LB小提酶切鉴定，结果是只有那个PCR条带比较亮的为阳性。
和师兄们讨论的时候考虑的因素有质粒丢失，体系污染等等。我的一个解释是，由于转化感受态细胞的连接产物中含有insert片段，即存在模板，接下来涂平板的时候模版insert会分布到整个平板上，挑克隆到PCR体系中的时候不可避免的接触到平板，然后将模板带入其中，而模板的量实在太少，故只能扩出一条很暗的条带。
我想这一定是一个老问题，不知道其他的朋友怎么解释以及避免这种情况出现
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