PCR产物末端加A,为什么加不上？
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我用takara的Pyrobest酶批的2000bp片断，切胶回收后立即进行加A反应，条件为：Start with 1–7µl of purified PCR fragment generated by a proofreading polymeras
Add 1µl Taq DNA Polymerase 10X Reaction Buffer with MgCl2.
Add dNTP to a final concentration of 0.2mM.
Add 5 units of Taq DNA Polymerase.
Add deionized water to a final reaction volume of 10µl.
Incubate at 70°C for 15–30 minutes.
然后立即使用4.5µl产物用于连接takara的pMD-18T载体
体系为：Solution 1 5µl
T vector 0.5µl
PCR加A产物 4.5µl
16度12-16小时连接
转化，结果没有克隆生长，转化的阳性对照长得很多
用同样体系连接普通TAQ批出的产物均为一次成功。我认为是A尾没有加上造成的。因为手头没有dATP,所以用dNTP代替，（仔细察过说明书，使dATP的终浓度达到0.2mM.）是不是这个原因呢？急！
请各位大虾指教
Add 1µl Taq DNA Polymerase 10X Reaction Buffer with MgCl2.
Add dNTP to a final concentration of 0.2mM.
Add 5 units of Taq DNA Polymerase.
Add deionized water to a final reaction volume of 10µl.
Incubate at 70°C for 15–30 minutes.
然后立即使用4.5µl产物用于连接takara的pMD-18T载体
体系为：Solution 1 5µl
T vector 0.5µl
PCR加A产物 4.5µl
16度12-16小时连接
转化，结果没有克隆生长，转化的阳性对照长得很多
用同样体系连接普通TAQ批出的产物均为一次成功。我认为是A尾没有加上造成的。因为手头没有dATP,所以用dNTP代替，（仔细察过说明书，使dATP的终浓度达到0.2mM.）是不是这个原因呢？急！
请各位大虾指教
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