电镜 非典型肺炎患者衣原体样 冠状病毒样颗粒
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http://www.chinacdc.net.cn/feiyan/4.25/bing4.25.htm
电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒样颗粒
洪涛 王健伟 孙异临 段淑敏 陈良标 屈建国 倪安平 梁国栋 任丽丽 杨仁全
郭岚 周为民 陈杰 李德新 许文波 徐红 郭元吉 戴淑玲 毕胜利 董小平 阮力
100052北京中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
[摘要]目的 探索2002年未暴发于广东等地的非典型肺炎的病原。
方法 对来自广东、山西、四川省和北京市的7例非典型肺炎死亡病人的尸体解剖标本进行超薄切片电镜观察,将病人肺组织提取物接种于293细胞(人胚肾转化细胞系),分离病原,对病人组织中和分离的病原进行免疫学鉴定。
结果 超薄切片电镜观察,在死亡患者的肺(7例)、脾(2例)、肝(2例)、肾(3例)和淋巴结(1例)中均观察到衣原体样包涵体和网质小体、中间体、原生小体颗粒的存在,并在3例病人肺组织中同时见到了冠状病毒样颗粒和未知的基质样结构。用RT-PCR方法从2例病人肺组织中扩增出冠状病毒RNA聚合酶基因片段。将病人肺组织提取物接种于293细胞进行培养,取第2代细胞作电镜观察,也发现衣原体样颗粒和包涵体的存在。在病人组织和培养细胞中见到的衣原体样颗粒均不能与衣原体属特异性抗体和抗肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体抗体反应,提示可能为新的衣原体样因子。
结论 在死亡病人组织和培养细胞中发现的衣原体样和冠状病毒样颗粒,可能是广东等地暴发的非典型肺炎的主要病原。
[关键词]衣原休科；冠状病毒科；显微镜检查；电子；非典型肺炎
Chlamydia-like and coronavirus-like agents found in dead cases of atypical pneumonia by electron microscopy HONG Tao., WANG Jian-wei, SUN Yi-lin, DUAN Shu-min, CHEN
Liang-biao, QU Jian-guo, NI An-ping, LIANG Guo-dong, REN Li-li, YANG Ren-quan,GU0
Lan,ZH0U Wei-min, CHEN Jie, LI De4-xin,XU Wen-bo, XU Hong, GUO Yuan-ji, DAI Shu-ling, BI Sheng-li, DONG Xiao-ping,RUAN Li.
*Institute of viral Disease Control and Prevention,China CDC,Beijing 100052,China
Corresponding author:HONG Tao(Email:hungt@public3.bta.net.cn)
[Abstract]Objective To explore the causative agents of the atypical pneumonia(also SARS)occurred recently in some regions of our country. Method Organ samples of 7 dead cases of SARS were collected from Guangdong, Shanxi, Sichuan Provinces and Beijing for electron microscopic examination.293 cell line Was inoculated with the materials derived from the lungs to isolate causative agent(s).The agents in the organs and cell
cultures were revealed by immunoassay. Results Both Chlamydia-like and coronavirus-like particles were found in EM. Inclusion bodies containing elementary dodies, reticulate antibodies and intermediate bodies of Chlamydia-like agent were visualized in multiple organs from the 7 dead case, including lungs(7 cases), spleens(2 cases),livers(2 cases),kidneys(3 cases)and lymph nodes(1 cases),by ultrathin section electron microscopy(EM).In some few sections, coronavirus-like particles were concurrently seen. A coronavirous RNA-polymerase segment(440bp)was amplified from the lung tissues of two cases of the SARS. After inoculated with materials from the lung samples, the similar Chlamydia-like particles were also found in the inoclated 293 cells. Since the Chlamydia-like agents visualized in both organs and cell cultures could not react with the genus specific antibodies against Chlamydia and monoclonal
antibodies against C. pneumoniae and C. psittaci, the results might well be suggestive of a novel Chlamydia-like agent. Conclusion Since the novel Chlamydia-like agent Was found co-existing of a coronavirus-1ike agent in the dead cases of SARS, it looks most likely that both the agents play some roles in the diseas. At the present time, however, one can hard1y determining how did these agents interact each other synergetically, or one follows another, need further study.
自2002年11月中旬开始,我国广东省境内出现了一种不寻常的传染病一一-非典型肺炎(atypicalpneumonia),该病最近被世界卫生组织(WH0)暂时定名为严重的急性呼吸综合征(severe acuteIespiratory syndrome,SARS)。据WH0统计,截至2003年3月25日,累及15个国家和地区,其中包括我国的广州、香港特别行政区、山西、广西和北京等地以及越南、泰国、德国、加拿大和美国的个别城市。死亡患者尸体解剖见全肺严重充血肿胀,呈肝样实变;有的尸体胸腔大量积水,腹腔也有积水,积水有的呈血性;肝、脾、肾等多器官充血、肿胀。我们对来自广东、山西、四川、北京等地的7例非典型肺炎死亡患者的尸检器官样品和组织培养细胞进行了电镜观察,以探索此次流行的非典型肺炎的病原。
材料与方法
一、 材料
1.尸检标本:取自7例在本次流行中死亡并被确诊为非典型性肺炎的病人,死亡后进行尸体解剖,并采集脏器组织标本。其中4例来自广东省(编号为1~4),标本由广东省疾病预防控制中心提供;1例来自山西省(编号为5);1例来自北京佑安医院(编号为6);1例系香港病人,死于成都(编号为7),标本由四川省疾病预防控制中心提供。非肺炎的肺癌病人切除组织由北京同仁医院提供。
2.细胞系:293细胞(人胚肾转化细胞系)由本所病毒保藏中心提供。
3.抗原、抗体与试剂盒:鹦鹉热衣原体抗体分别由北京协和医院检验科和军事医学科学院五所端青研究员提供,鹦鹉热衣原体与肺炎衣原体阳性对照免疫荧光片、肺炎衣原体和衣原体属特异性抗体由北京协和医院检验科提供。肺炎衣原体IgM、IgG诊断试剂盒购自华美试剂公司。FTTC标记的抗人IgG、IgM抗体购自美国Santa Cruz公司。,trizol试剂逆转录酶Superscript II、Taq酶购自美国Invitrogen公司。
二、 方法
1. 电镜标本的制作：所有尸检标本经戊二醛固定后，进行超薄切片和电镜观察。
2. 病理标本的制作：尸检肺组织经甲醛固定、灭活后，按常规方法进行包埋和病理组织切片。
3.病原分离培养:尸检肺组织经研磨后,离心去除组织块,取上清,经孔径为0.22件µm的滤膜过滤和青、链霉素、红霉素处理后,接种于293细胞,37℃培养,传2代后进行电镜观察。
4.间接免疫荧光和免疫组织化学:均按常规法进行。
5.冠状病毒RNA聚合酶基因的巢式RT-***(检测:按WH0提供的方法进行。将部分病人肺组织做成20%匀浆后,用Trizol试剂提取RNA(按产品说明书进行),首先用随机引物进行逆转录反应,42℃,60min然后,取5µl逆转录产物为模板;进行第一轮PCR反应,引物序列为C1:5’GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3',C2:5’TAACACACAAACACCATCATCA3',反应条件为94℃1 min,52℃,1 min,72℃,1 min。共进行30个循环。到然后取5µl第一轮PCR产物为模板,进行第二轮PCR,引物序列为C3:5’GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3', **:5'CCATCATCAGATAGAATCATCATA3', 除了将退火温度降为49℃外,其余条件与第一轮PCR相同。最后取5µl PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,将目的DNA片段回收后进行DNA序列分析。
结果
一、 在尸检组织中发现衣原体样颗粒
将7例死亡患者的组织标本经超薄切片行电镜观察,在肺等多个脏器中均发现了衣原体样颗粒的存在。在肺、脾、肝、肾和淋巴结组织里都发现了衣原体的包涵体和相应组成包涵体的网质小体(reticulate body)、中间体(intermediate body)和原生小体(elementary body)。包涵体位于细胞质内,呈空泡状,一个细胞中往往可见多个包涵体,有时包涵体很大,占据整个细胞质,使细胞膨胀,细胞核被挤压到细胞的一边,而变形或浓缩碎裂,而且常见细胞核深深的块状坏死。衣原体颗粒的形态结构基本上与鹦鹉热衣原体相同,网质小体较大,约0.3―1.0µm,呈圆型或椭圆型,质地比较松散,内含细小分散的透明颗粒,外周有明显的一层外膜状物包裹。中间体体积比网质体小,约0.2-0.8µm,呈多型性,其内常可见到偏心而浓密的核样物,以切面不同,显出不同的形态和大小,颇似人类免疫缺陷病毒颗粒;原生小体更加浓缩,电子致密,而且体积很小,大多在0.1-0.2µm左右,在其内部见不到任何结构,在高倍放大下,可见一层松散、弯曲的薄膜包绕。上述衣原体样颗粒同时可在肺泡内渗出物中见到,此时往往以原生小体为多,有的可见少量冠状病毒样颗粒。包涵体也常常可在坏死脱落的肺泡上皮细胞内见到,在此情况下,原生小体往往成了包涵体的主要成分。
二、在尸检组织中同时发现冠状病毒样颗粒
在3号、4号和7号病人的肺组织细胞的胞质内,除了衣原体样颗粒外,还见到了疑似冠状病毒样颗粒,其大小约100-150nm,在电子致密的核心外周隐约可见少量纤突状结构。此外,在病人肺组织超薄切片上还见到着色很深的、似由很细的纤维组成的不明结构。另外,在发现衣原体的细胞质里偶尔见到细胞内膜曲折回转,在其胞质E见到电子致密的基质样结构,其性质未明,有待研究。
三、从病人肺组织中检测到冠状病毒RNA聚才酶基因片段
利用巢式RT-PCR方法,我们从4号、7号死亡病人肺组织中扩增出长度为440bp的冠状病RNA聚合酶基因片段,序列分析表明我们获得的cDNA序列与WH0公布的序列是一致的,并且从2例患者肺组织中扩增出的基因序列也是一致的,但没有患非典型肺炎的肺癌病人切除肺组织中没有扩增出冠状病毒基因,表明非典型肺炎病人肺组织中有冠状病毒的存在。对于更多病人组织标本中冠状病毒基因的检测还在进行中。
四、在培养细胞中分离到衣原体样颗粒
将3号、4号、5号病人肺组织提取物接种于293细胞,4d后细胞出现聚集、圆缩、脱落等病理改变。细胞培养中第2代出现上述病理改变的时间4d,第3代为7d,第4代为12d。收集第2代细胞进行超薄切片电镜观察,见细胞质内充满大量的原体样网质小体、中间体和原生小体,其清晰度优于尸检组织。正常对照细胞中未见到衣原体样颗粒。
五、血清学特征
鉴于在死亡病人组织中看到了大量的衣原体颗粒,为了对其进行定性,我们首先调查了病人血清中肺炎衣原体抗体的存在情况,对107份来自广东的非典型肺炎病人血清进行了检测,只有15份IgM为阳性,因此肺炎衣原体不可能是非典型肺炎的病原。为了确定我们所看到的衣原体样颗粒是否为已知的衣原体,我们将病人肺组织切片后,分别用衣原体属特异性单克隆抗体和肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体种单克隆抗体进行免疫组织化学和间接免疫荧光检测,结果均为阴性。将组织培养物用衣原体属特异性抗体进行检测,结果也为阴性。这些结果提示,我们所见到的衣原体样颗粒的抗原性与现有已知的衣原体是不同的。进而将5号病人的淋巴结压片后,分别用来自广东省和山西省的13份病人血清,进行免疫荧光检测,全部为阳性,说明淋巴结中含有本次非典型肺炎暴发的病原,但是,用衣原体的属特异性荧光抗体检测却为阴性,说明已知的肺炎、鹦鹉热等衣原体不是非典型肺炎的病原。非典型肺炎死亡病人组织和细胞培养物对衣原体抗体的免疫检测结果我们在来自不同地区(广东省、山西省、四川省和北京市)不同医院的非典型肺炎患者的尸检肺、肝、脾、肾等器官里看到了衣原体样颗粒,在3例病人肺组织标本中还同时看到了冠状病毒样颗粒。相继将尸检肺组织进行了培养细胞和传代,所接种的293细胞出现病变,超薄切片电镜观察证明所见的细胞病理变化由衣原体样颗粒所致,分离的衣原体毒株已传代4次,但与已知的衣原体抗原性不同。这些初步结果提示一种新的衣原体样因子很可能是此次非典型肺炎的致病或死亡的病因之一。衣原体(Chlamydia)是一类严格的真核细胞内寄生的原核生物,目前被划分到衣原体科,该科只有一个衣原体属,其中沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和兽衣原体是4个最主要的种,已知肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体能引起人类肺炎。衣原体能通过细菌滤器,对粘膜表面的柱状上皮有嗜性。形态为圆形或椭圆形,具有细胞壁,其组成与革兰阴性菌相似,含有DNA和RNA两类核酸。对多种抗生素,尤其是大环内酶类抗生素敏感。衣原体目前被认为是社区获得性肺炎(community acquired是pneumonia)的重要病因。虽然衣原体已经被发现多年,但是人类对其认识还很不够。近年来,国际上报道了一些新的衣原体样因子,如副衣原体科(Paracharr1ydia
acanthamoebae)和SimKamanegeverIsis,这些因子与医院内感染和社区获得性肺炎有关[111]。基于我们电镜研究的初步结果,我们认为所见到的衣原体样颗粒可能是一种新的,也许是变异的衣原体。因为除了上述证据之外,还有以下一些间接证据,即临床上此病对大多常用的抗生素不敏感,如大环内醋类抗生素;病原的毒力强,传播快,病人白细胞不仅没有显著升高,相反往往出现明显降低的情况。目前我们正在使用衣原体多克隆抗体、补体结合试验和免疫组织化学、原位杂交等实验进行进一步鉴定。
冠状病毒(coronavirus)是一种RNA病毒,因形似王冠而得名,其形态为圆形、椭圆形或轻度多形性,直径为100-120nm,表面的棒状突起长约20nm,外面有脂质双层膜。该病毒在世界范围内广泛存在,感染多发于冬春季。冠状病毒感染可造成上呼吸道疾患、肺炎、腹泻等,人类和动物感染率很高,但严重疾病的暴发迄今未见报道。
目前不能排除变异的冠状病毒引起本次暴发疫情的可能。当前,关于非典型肺炎的病原学研究出现了复杂的局面。经过国家疾病预防控制中心和广东省专家的努力,目前已经排除了细菌、支原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、腺病毒、汉坦病毒、流感病毒、麻莎病毒等多种可能引起肺炎的病原。近来WH0和有关研究单位宣布分离到一种新的冠状病毒,并把非典型肺炎改称为冠状病毒肺炎(comnaviruspneumonia)。我们认为,在新的疾病出现初期,关于病原的研究出现不同的报道是不足为奇的。在本文7例尸检标本的研究中,我们在发现衣原体样因子的同时,也特别关注其他可能的病原,并在3例肺标本中也见到了冠状病毒样颗粒,其本质为何,尚需进一步研究。我们也从2例肺组织中,利用RT-PCR技术扩增出与国外报道的序列一致的冠状病毒RNA聚合酶基因片段,表明冠状病毒的存在。究竟衣原体样因子和冠状病毒在非典型肺炎的发病和死亡中发挥何种作用,尚需要进一步的研究。
志谢广东省疾病预防控制中心、广州市疾病预防控制中心、第一军医大南方医院、北京神经外科研究所、北京协和医院、军事医学科学院和北京同仁医院给予大力协助
来源：《中华医学杂志》，第83卷第8期632-636页，2003年4月25日
电镜观察从非典型肺炎患者尸检标本中发现衣原体样和冠状病毒样颗粒
洪涛 王健伟 孙异临 段淑敏 陈良标 屈建国 倪安平 梁国栋 任丽丽 杨仁全
郭岚 周为民 陈杰 李德新 许文波 徐红 郭元吉 戴淑玲 毕胜利 董小平 阮力
100052北京中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所
[摘要]目的 探索2002年未暴发于广东等地的非典型肺炎的病原。
方法 对来自广东、山西、四川省和北京市的7例非典型肺炎死亡病人的尸体解剖标本进行超薄切片电镜观察,将病人肺组织提取物接种于293细胞(人胚肾转化细胞系),分离病原,对病人组织中和分离的病原进行免疫学鉴定。
结果 超薄切片电镜观察,在死亡患者的肺(7例)、脾(2例)、肝(2例)、肾(3例)和淋巴结(1例)中均观察到衣原体样包涵体和网质小体、中间体、原生小体颗粒的存在,并在3例病人肺组织中同时见到了冠状病毒样颗粒和未知的基质样结构。用RT-PCR方法从2例病人肺组织中扩增出冠状病毒RNA聚合酶基因片段。将病人肺组织提取物接种于293细胞进行培养,取第2代细胞作电镜观察,也发现衣原体样颗粒和包涵体的存在。在病人组织和培养细胞中见到的衣原体样颗粒均不能与衣原体属特异性抗体和抗肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体抗体反应,提示可能为新的衣原体样因子。
结论 在死亡病人组织和培养细胞中发现的衣原体样和冠状病毒样颗粒,可能是广东等地暴发的非典型肺炎的主要病原。
[关键词]衣原休科；冠状病毒科；显微镜检查；电子；非典型肺炎
Chlamydia-like and coronavirus-like agents found in dead cases of atypical pneumonia by electron microscopy HONG Tao., WANG Jian-wei, SUN Yi-lin, DUAN Shu-min, CHEN
Liang-biao, QU Jian-guo, NI An-ping, LIANG Guo-dong, REN Li-li, YANG Ren-quan,GU0
Lan,ZH0U Wei-min, CHEN Jie, LI De4-xin,XU Wen-bo, XU Hong, GUO Yuan-ji, DAI Shu-ling, BI Sheng-li, DONG Xiao-ping,RUAN Li.
*Institute of viral Disease Control and Prevention,China CDC,Beijing 100052,China
Corresponding author:HONG Tao(Email:hungt@public3.bta.net.cn)
[Abstract]Objective To explore the causative agents of the atypical pneumonia(also SARS)occurred recently in some regions of our country. Method Organ samples of 7 dead cases of SARS were collected from Guangdong, Shanxi, Sichuan Provinces and Beijing for electron microscopic examination.293 cell line Was inoculated with the materials derived from the lungs to isolate causative agent(s).The agents in the organs and cell
cultures were revealed by immunoassay. Results Both Chlamydia-like and coronavirus-like particles were found in EM. Inclusion bodies containing elementary dodies, reticulate antibodies and intermediate bodies of Chlamydia-like agent were visualized in multiple organs from the 7 dead case, including lungs(7 cases), spleens(2 cases),livers(2 cases),kidneys(3 cases)and lymph nodes(1 cases),by ultrathin section electron microscopy(EM).In some few sections, coronavirus-like particles were concurrently seen. A coronavirous RNA-polymerase segment(440bp)was amplified from the lung tissues of two cases of the SARS. After inoculated with materials from the lung samples, the similar Chlamydia-like particles were also found in the inoclated 293 cells. Since the Chlamydia-like agents visualized in both organs and cell cultures could not react with the genus specific antibodies against Chlamydia and monoclonal
antibodies against C. pneumoniae and C. psittaci, the results might well be suggestive of a novel Chlamydia-like agent. Conclusion Since the novel Chlamydia-like agent Was found co-existing of a coronavirus-1ike agent in the dead cases of SARS, it looks most likely that both the agents play some roles in the diseas. At the present time, however, one can hard1y determining how did these agents interact each other synergetically, or one follows another, need further study.
自2002年11月中旬开始,我国广东省境内出现了一种不寻常的传染病一一-非典型肺炎(atypicalpneumonia),该病最近被世界卫生组织(WH0)暂时定名为严重的急性呼吸综合征(severe acuteIespiratory syndrome,SARS)。据WH0统计,截至2003年3月25日,累及15个国家和地区,其中包括我国的广州、香港特别行政区、山西、广西和北京等地以及越南、泰国、德国、加拿大和美国的个别城市。死亡患者尸体解剖见全肺严重充血肿胀,呈肝样实变;有的尸体胸腔大量积水,腹腔也有积水,积水有的呈血性;肝、脾、肾等多器官充血、肿胀。我们对来自广东、山西、四川、北京等地的7例非典型肺炎死亡患者的尸检器官样品和组织培养细胞进行了电镜观察,以探索此次流行的非典型肺炎的病原。
材料与方法
一、 材料
1.尸检标本:取自7例在本次流行中死亡并被确诊为非典型性肺炎的病人,死亡后进行尸体解剖,并采集脏器组织标本。其中4例来自广东省(编号为1~4),标本由广东省疾病预防控制中心提供;1例来自山西省(编号为5);1例来自北京佑安医院(编号为6);1例系香港病人,死于成都(编号为7),标本由四川省疾病预防控制中心提供。非肺炎的肺癌病人切除组织由北京同仁医院提供。
2.细胞系:293细胞(人胚肾转化细胞系)由本所病毒保藏中心提供。
3.抗原、抗体与试剂盒:鹦鹉热衣原体抗体分别由北京协和医院检验科和军事医学科学院五所端青研究员提供,鹦鹉热衣原体与肺炎衣原体阳性对照免疫荧光片、肺炎衣原体和衣原体属特异性抗体由北京协和医院检验科提供。肺炎衣原体IgM、IgG诊断试剂盒购自华美试剂公司。FTTC标记的抗人IgG、IgM抗体购自美国Santa Cruz公司。,trizol试剂逆转录酶Superscript II、Taq酶购自美国Invitrogen公司。
二、 方法
1. 电镜标本的制作：所有尸检标本经戊二醛固定后，进行超薄切片和电镜观察。
2. 病理标本的制作：尸检肺组织经甲醛固定、灭活后，按常规方法进行包埋和病理组织切片。
3.病原分离培养:尸检肺组织经研磨后,离心去除组织块,取上清,经孔径为0.22件µm的滤膜过滤和青、链霉素、红霉素处理后,接种于293细胞,37℃培养,传2代后进行电镜观察。
4.间接免疫荧光和免疫组织化学:均按常规法进行。
5.冠状病毒RNA聚合酶基因的巢式RT-***(检测:按WH0提供的方法进行。将部分病人肺组织做成20%匀浆后,用Trizol试剂提取RNA(按产品说明书进行),首先用随机引物进行逆转录反应,42℃,60min然后,取5µl逆转录产物为模板;进行第一轮PCR反应,引物序列为C1:5’GGGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3',C2:5’TAACACACAAACACCATCATCA3',反应条件为94℃1 min,52℃,1 min,72℃,1 min。共进行30个循环。到然后取5µl第一轮PCR产物为模板,进行第二轮PCR,引物序列为C3:5’GGTTGGGACTATCCTAAGTGTGA3', **:5'CCATCATCAGATAGAATCATCATA3', 除了将退火温度降为49℃外,其余条件与第一轮PCR相同。最后取5µl PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳检测,将目的DNA片段回收后进行DNA序列分析。
结果
一、 在尸检组织中发现衣原体样颗粒
将7例死亡患者的组织标本经超薄切片行电镜观察,在肺等多个脏器中均发现了衣原体样颗粒的存在。在肺、脾、肝、肾和淋巴结组织里都发现了衣原体的包涵体和相应组成包涵体的网质小体(reticulate body)、中间体(intermediate body)和原生小体(elementary body)。包涵体位于细胞质内,呈空泡状,一个细胞中往往可见多个包涵体,有时包涵体很大,占据整个细胞质,使细胞膨胀,细胞核被挤压到细胞的一边,而变形或浓缩碎裂,而且常见细胞核深深的块状坏死。衣原体颗粒的形态结构基本上与鹦鹉热衣原体相同,网质小体较大,约0.3―1.0µm,呈圆型或椭圆型,质地比较松散,内含细小分散的透明颗粒,外周有明显的一层外膜状物包裹。中间体体积比网质体小,约0.2-0.8µm,呈多型性,其内常可见到偏心而浓密的核样物,以切面不同,显出不同的形态和大小,颇似人类免疫缺陷病毒颗粒;原生小体更加浓缩,电子致密,而且体积很小,大多在0.1-0.2µm左右,在其内部见不到任何结构,在高倍放大下,可见一层松散、弯曲的薄膜包绕。上述衣原体样颗粒同时可在肺泡内渗出物中见到,此时往往以原生小体为多,有的可见少量冠状病毒样颗粒。包涵体也常常可在坏死脱落的肺泡上皮细胞内见到,在此情况下,原生小体往往成了包涵体的主要成分。
二、在尸检组织中同时发现冠状病毒样颗粒
在3号、4号和7号病人的肺组织细胞的胞质内,除了衣原体样颗粒外,还见到了疑似冠状病毒样颗粒,其大小约100-150nm,在电子致密的核心外周隐约可见少量纤突状结构。此外,在病人肺组织超薄切片上还见到着色很深的、似由很细的纤维组成的不明结构。另外,在发现衣原体的细胞质里偶尔见到细胞内膜曲折回转,在其胞质E见到电子致密的基质样结构,其性质未明,有待研究。
三、从病人肺组织中检测到冠状病毒RNA聚才酶基因片段
利用巢式RT-PCR方法,我们从4号、7号死亡病人肺组织中扩增出长度为440bp的冠状病RNA聚合酶基因片段,序列分析表明我们获得的cDNA序列与WH0公布的序列是一致的,并且从2例患者肺组织中扩增出的基因序列也是一致的,但没有患非典型肺炎的肺癌病人切除肺组织中没有扩增出冠状病毒基因,表明非典型肺炎病人肺组织中有冠状病毒的存在。对于更多病人组织标本中冠状病毒基因的检测还在进行中。
四、在培养细胞中分离到衣原体样颗粒
将3号、4号、5号病人肺组织提取物接种于293细胞,4d后细胞出现聚集、圆缩、脱落等病理改变。细胞培养中第2代出现上述病理改变的时间4d,第3代为7d,第4代为12d。收集第2代细胞进行超薄切片电镜观察,见细胞质内充满大量的原体样网质小体、中间体和原生小体,其清晰度优于尸检组织。正常对照细胞中未见到衣原体样颗粒。
五、血清学特征
鉴于在死亡病人组织中看到了大量的衣原体颗粒,为了对其进行定性,我们首先调查了病人血清中肺炎衣原体抗体的存在情况,对107份来自广东的非典型肺炎病人血清进行了检测,只有15份IgM为阳性,因此肺炎衣原体不可能是非典型肺炎的病原。为了确定我们所看到的衣原体样颗粒是否为已知的衣原体,我们将病人肺组织切片后,分别用衣原体属特异性单克隆抗体和肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体种单克隆抗体进行免疫组织化学和间接免疫荧光检测,结果均为阴性。将组织培养物用衣原体属特异性抗体进行检测,结果也为阴性。这些结果提示,我们所见到的衣原体样颗粒的抗原性与现有已知的衣原体是不同的。进而将5号病人的淋巴结压片后,分别用来自广东省和山西省的13份病人血清,进行免疫荧光检测,全部为阳性,说明淋巴结中含有本次非典型肺炎暴发的病原,但是,用衣原体的属特异性荧光抗体检测却为阴性,说明已知的肺炎、鹦鹉热等衣原体不是非典型肺炎的病原。非典型肺炎死亡病人组织和细胞培养物对衣原体抗体的免疫检测结果我们在来自不同地区(广东省、山西省、四川省和北京市)不同医院的非典型肺炎患者的尸检肺、肝、脾、肾等器官里看到了衣原体样颗粒,在3例病人肺组织标本中还同时看到了冠状病毒样颗粒。相继将尸检肺组织进行了培养细胞和传代,所接种的293细胞出现病变,超薄切片电镜观察证明所见的细胞病理变化由衣原体样颗粒所致,分离的衣原体毒株已传代4次,但与已知的衣原体抗原性不同。这些初步结果提示一种新的衣原体样因子很可能是此次非典型肺炎的致病或死亡的病因之一。衣原体(Chlamydia)是一类严格的真核细胞内寄生的原核生物,目前被划分到衣原体科,该科只有一个衣原体属,其中沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和兽衣原体是4个最主要的种,已知肺炎衣原体和鹦鹉热衣原体能引起人类肺炎。衣原体能通过细菌滤器,对粘膜表面的柱状上皮有嗜性。形态为圆形或椭圆形,具有细胞壁,其组成与革兰阴性菌相似,含有DNA和RNA两类核酸。对多种抗生素,尤其是大环内酶类抗生素敏感。衣原体目前被认为是社区获得性肺炎(community acquired是pneumonia)的重要病因。虽然衣原体已经被发现多年,但是人类对其认识还很不够。近年来,国际上报道了一些新的衣原体样因子,如副衣原体科(Paracharr1ydia
acanthamoebae)和SimKamanegeverIsis,这些因子与医院内感染和社区获得性肺炎有关[111]。基于我们电镜研究的初步结果,我们认为所见到的衣原体样颗粒可能是一种新的,也许是变异的衣原体。因为除了上述证据之外,还有以下一些间接证据,即临床上此病对大多常用的抗生素不敏感,如大环内醋类抗生素;病原的毒力强,传播快,病人白细胞不仅没有显著升高,相反往往出现明显降低的情况。目前我们正在使用衣原体多克隆抗体、补体结合试验和免疫组织化学、原位杂交等实验进行进一步鉴定。
冠状病毒(coronavirus)是一种RNA病毒,因形似王冠而得名,其形态为圆形、椭圆形或轻度多形性,直径为100-120nm,表面的棒状突起长约20nm,外面有脂质双层膜。该病毒在世界范围内广泛存在,感染多发于冬春季。冠状病毒感染可造成上呼吸道疾患、肺炎、腹泻等,人类和动物感染率很高,但严重疾病的暴发迄今未见报道。
目前不能排除变异的冠状病毒引起本次暴发疫情的可能。当前,关于非典型肺炎的病原学研究出现了复杂的局面。经过国家疾病预防控制中心和广东省专家的努力,目前已经排除了细菌、支原体、鹦鹉热衣原体、肺炎衣原体、腺病毒、汉坦病毒、流感病毒、麻莎病毒等多种可能引起肺炎的病原。近来WH0和有关研究单位宣布分离到一种新的冠状病毒,并把非典型肺炎改称为冠状病毒肺炎(comnaviruspneumonia)。我们认为,在新的疾病出现初期,关于病原的研究出现不同的报道是不足为奇的。在本文7例尸检标本的研究中,我们在发现衣原体样因子的同时,也特别关注其他可能的病原,并在3例肺标本中也见到了冠状病毒样颗粒,其本质为何,尚需进一步研究。我们也从2例肺组织中,利用RT-PCR技术扩增出与国外报道的序列一致的冠状病毒RNA聚合酶基因片段,表明冠状病毒的存在。究竟衣原体样因子和冠状病毒在非典型肺炎的发病和死亡中发挥何种作用,尚需要进一步的研究。
志谢广东省疾病预防控制中心、广州市疾病预防控制中心、第一军医大南方医院、北京神经外科研究所、北京协和医院、军事医学科学院和北京同仁医院给予大力协助
来源：《中华医学杂志》，第83卷第8期632-636页，2003年4月25日
