【原创】鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制

不动杆菌属（Acinetobacter）是非发酵、需氧的一类革兰氏阴性球杆菌， 分为醋酸钙不动杆菌（A.calcoaceticus）、溶血不动杆菌(A.haemolyticus)、鲍曼不动杆菌(A.baumanii)、琼氏不动杆菌(A.junii)、约翰逊氏不动杆菌(A.johnsonii)、洛菲氏不动杆菌（A.lwoffii），而其中鲍曼不动杆菌毫无疑问是引起临床关注的最常见的不动杆菌。它广泛分布于医院环境，可导致免疫低下的患者发生严重的院内感染，如呼吸机相关性肺炎、泌尿系感染、继发性脑膜炎、外科手术部位感染等，尤其是重症监护室的患者。根据NNIS和中国院内感染病原菌耐药监测资料显示，鲍曼不动杆菌在院内感染占第四位，成为仅次于铜绿假单孢菌的非发酵菌[1,2]。
鲍曼不动杆菌曾经对青霉素、头孢菌素、氨基糖甙类、喹诺酮类抗生素等敏感，但随着广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛使用等原因，世界各地很多国家都有关于鲍曼不动杆菌泛耐药菌（PDR-AB）或多重耐药菌（MDR-AB）的报道。
碳青霉烯类抗生素作为新型的β-内酰胺类抗生素，可以抵抗包括超广谱β-内酰胺酶和AmpC在内的大多数β-内酰胺酶水解，与青霉素结合蛋白亲和力强，能有效透过细菌外膜进入周质间隙，具有抗菌谱广、杀菌活性强的特点，被认为是目前临床治疗鲍曼不动杆菌感染最有效的抗菌药物之一，目前常用的主要是亚胺培南（Imipenem）和美洛培南(Meropenem)。近年来世界各地关于耐碳青霉烯类抗生素的鲍曼不动杆菌（CRAB）耐药比例也逐渐增高，一旦细菌对碳青霉烯类抗生素耐药，则对其他抗生素亦基本都耐药，患者往往死于无药可选[3]，因而如何治疗这类多耐药或泛耐药的鲍曼不动杆菌感染已经成为一个临床难题。

1．  鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制及分子流行病学研究
目前研究所示鲍曼不动杆菌逃避碳青霉烯类抗生素的耐药机制主要有以下几点：①产生水解药物的碳青霉烯类酶；②与青霉素结合蛋白的亲和力降低；③外膜通道蛋白表达下调或缺如，使透入细菌外膜的药量减少；④细菌膜上的主动外排泵将透入菌膜的药物泵出体外。
1．1产生碳青霉烯酶
碳青霉烯酶指所有能水解碳青霉烯类的β-内酰胺酶，按基因来源可分为天然来源和获得性来源两类，天然来源者在碳青霉烯类抗生素应用于临床前就存在于细菌中，由染色体介导，很少在不同菌属间传播；而获得性碳青霉烯酶的编码序列是定位在质粒、整合子等可以转移的基因元件上，可以在细菌间横向传播。
依据Ambler分子分类将碳青霉烯酶分为三类：①A类酶，为丝氨酸蛋白酶，很少见，可被克拉维酸和他唑巴坦抑制；②B类酶，为金属β-内酰胺酶，其活性位点有锌离子，可被金属螯合剂依地酸（EDTA）和巯基类化合物（2-MPA）抑制，不能被克拉维酸、他唑巴坦和舒巴坦抑制，多数B类金属酶对亚胺培南的水解活性大于美洛培南，目前已发现的B类金属酶有IMP类、VIM类，SIM类等；③D类酶，为苯唑西林酶（OXA酶），得名于其对苯唑西林的水解活性强，BUSH分群中属于2d类，可被舒巴坦抑制[4,5]。在鲍曼不动杆菌中，水解碳青霉烯类抗生素的酶主要是B类金属酶和D类酶。
我国学者王辉等收集2003-2004年我国10家教学医院187株鲍曼不动杆菌，采用脉冲场 凝胶电泳和随机扩增多态性技术进行流行病学研究，并对多种β-内酰胺酶基因及整合子基因进行聚合酶链反应（PCR）及序列分析，得出CRAB克隆株的传播是造成中国多家医院碳青酶烯类抗生素耐药率增加的重要原因，耐药克隆菌株均产生OXA-23型碳青酶烯酶或I MP-8型金属酶、PER-1型酶、高产AmpC酶和TEM-1酶是造成中国多家医院碳青酶烯类抗生素耐药率增加的重要原因[6]。上海瑞金医院和香港的一项联合研究也表明产OXA-23和PER-1型β-内酰胺酶的CRAB占优势，并且已经播散到其他不同的克隆株[7]。比利时的一项对2004年9月-2005年8月收集的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌研究亦表明耐药菌产OXA-58[8]。
1．  2与青霉素结合蛋白的亲和力下降
碳青霉烯类抗生素与其他的β-内酰胺类抗生素一样，通过不可逆地灭活细菌的肽聚糖转肽酶而发挥杀菌作用，肽聚糖转肽酶可以催化细菌外膜的肽聚糖发生交联，保持细菌外膜完整，假若交联作用受到抑制，细菌外膜完整性破坏，导致细菌死亡，肽聚糖转肽酶属于青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins,PBps）成员。当PBPs数量或构型发生变化时，药物不能与之结合或结合力下降，出现细菌对药物耐药现象。
由于青霉素结合蛋白的改变引起对碳青酶烯类抗生素耐药的研究结果比较少见。Gehrlein等研究一株对碳青酶烯类敏感的鲍曼不动杆菌，体外诱导耐药菌株，发现耐药突变株过度表达一种分子量24KD的青霉素结合蛋白，但其他六中青霉素结合蛋白却低水平表达[9]；Fernandez-Guenca F等的研究发现，对亚胺培南耐药程度不同的鲍曼不动杆菌中存在12种结构的青霉素结合蛋白，在对亚胺培南的MIC＞4mg/L的菌株，除了产生碳青酶烯酶以外，还一种分子量为73.2KDa的青霉素结合蛋白缺失表达[10]。
1．  3外膜通道蛋白表达下调或缺如
细菌外膜构成半透性的屏障，外膜通道蛋白又称外膜孔蛋白（porins）组成亲水性通道，可以作为分子筛容许亲水的小分子物质通过，细菌改变外膜蛋白的结构或者调节外膜通道蛋白的表达来减少抗生素透入菌膜从而逃逸抗生素的杀菌作用。鲍曼不动杆菌外膜通道蛋白含量较少，通透性很低。
王辉等学者还采用SDS-PAGE分析体外亚胺培南CRAB突变菌株的外膜通道蛋白，发现OMP20KD的缺失，OMP29KD和OMP21KD的表达降低[6]。Adriana S等比较基因型相同的分别对亚胺培南敏感和耐药的鲍曼不动杆菌AB288和AB242的外膜蛋白，发现耐药菌的外膜蛋白缺如分子量约29KD的条带；将敏感菌经水杨酸钠处理后，则产生耐药，并且无分子量为29KD的蛋白表达；用亚胺培南药物递增培养方法诱导出的耐药菌亦发现29KD的外膜蛋白缺失表达[11]。
1．  4主动外排泵系统
在革兰氏阴性杆菌中，细菌外膜限制抗生素透入细菌外膜，而主动外排系统则主动地将透入膜内尚未发生作用的抗生素或其他物质排出菌体外，降低药物的作用浓度，从而保护菌体以免受到侵害。当主动外排系统过度表达时，细菌更容易产生耐药[12]。
主动外排系统存在于多种细菌，由三部分组成：外膜孔道（exit portal）位于外膜上，直接与位于内膜的外排泵（pump）相对、而位于它俩之间的辅助蛋白[又称连接蛋白（linker lipoprotein）]则起协调作用。主动外排系统主要分为六类[12]：①易化扩散载体家族[major facilitator(MF) family]；②耐药性结节分化家族[resistance-nodulation divition(RND) family]；③葡萄球菌多重耐药家族[Smr,staphylococcal multidrug resistance family]；④ATP转运蛋白超家族[the ATP binding cassette(ABC) family]；⑤多药和毒化和物外排家族[the multidrug and toxic compound extrusion(MATE)；⑥药物代谢转运体家族[the drug/metabolite transporter(DMT) supergamily]。
鲍曼不动杆菌中，迄今发现的主动外排泵有AdeABC（属于RND家族）和Tet（属于MFS家族），AdeABC被认为是非选择性的外排泵系统，可将氯霉素、喹诺酮类、头孢噻肟等药物泵出菌体外，对碳青霉烯类抗生素的作用目前尚未明了。
Claire Héritier等研究者通过测定鲍曼不动杆菌菌株CIP70.10和它的点突变菌株BM4547（该突变菌株过表达AdeABC外排泵）对亚胺培南和美洛培南的MIC值，发现过表达AdeABC外排泵的菌株BM4547的MIC比菌株CIP70.10的MIC增高2倍，推测AdeABC外排泵在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制中可能是起作用的[13] 。Wensis Hu等研究者在临床分离的耐药菌株培养基中加入质子泵抑制剂CCCP后，发现细菌对亚胺培南的MIC降低了4-8倍[14]。
我国学者王辉、国外Bou G、Héritier C等学者研究结果还证明了临床发生的碳青酶烯类的鲍曼不动杆菌耐药菌株通常是多种耐药机制协同作用的[6，13，16，17]。中国多家医院碳青酶烯类抗生素耐药机制主要是产生碳青烯酶和多个外膜通道蛋白的缺失表达[6]；Bou G等的研究表明耐药菌对碳青酶烯类耐药的原因是产生OXA-24和2个外膜通道蛋白表达下调[15]；Héritier C等的研究表明产生OXA-23、OXA-58和主动外排泵系统协同引起鲍曼不动杆菌对碳青酶烯类的高度耐药[13] 。我们已经知道美洛培南对铜绿假单孢菌等革兰氏阴性杆菌的杀菌活性强于亚胺培南，而美国Rhomberg PR等自99年开始的长达6年的年度美洛培南敏感性信息监测计划（MYSTIC）则证实了与铜绿假单孢菌相反，在鲍曼不动杆菌中，亚胺培南的活性优于美洛培南[16]；但希腊学者S. Pournaras等的研究证实希腊某医院的鲍曼不动杆菌的耐药菌株，美洛培南的杀菌活性优于亚胺培南[17]。

2．  针对耐药机制、战胜耐药菌感染的研究方向和前景
细菌的耐药机制可以使其避免经典抗生素的杀菌或抑菌作用，因此直接针对耐药机制是开发多耐药菌感染治疗新药物的途径之一。
对于产酶的菌株可用加有酶抑制剂的抗生素，目前主要有克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦三种酶抑制剂，但是目前尚没有针对B类金属酶的酶抑制剂，而且这三种酶抑制剂只是分别单独针对A类或C类酶的，因而迫切需要研发同时针对C类酶、A类酶和B类金属酶的广谱酶抑制剂。
革兰氏阴性杆菌的低外膜通透性或外膜蛋白编码基因突变，与其他耐药机制协同作用以及可产生耐药性。针对外膜，通过透化因子作用破坏外膜的障碍是提高耐药菌敏感性的有效方法之一[12] ；抗生素与由于高亲合受体介导转运系统而可跨膜转运的铁载体连接亦可能战胜革兰氏阴性杆菌外膜的低通透性[18] 。
既然主动外排泵系统参与鲍曼不动杆菌对碳青酶烯类抗生素耐药机制，那么外排泵抑制剂则亦有可能是与外排泵介导的耐药相对抗的一种方法。目前已见报道的有针对耐药大肠杆菌和铜绿假单孢菌的特异性和广谱外排泵抑制剂[19]；而发明较少受外排泵系统影响的新型抗生素则是针对外排泵耐药机制的另一条研究途径，已有的这类抗生素如替加环素（tidecycline）,对多耐药的沙门氏菌、鲍曼不动杆菌和大肠杆菌有抗菌活性[20] 。

3.预防和避免鲍曼不动杆菌耐药的策略
鲍曼不动杆菌为院内感染重要的条件致病菌，具有分布广泛、生存力强、定植率高、耐药率高、传播性强特点，在高危人群中可引发严重的感染。1991年美国首例报道对碳青酶烯类耐药的鲍曼不动杆菌（CRAB）之后，世界各地如台湾、西班牙等地都有关于CRAB的报道及暴发流行[21,22]。其危险因素包括患者基础疾病状态、侵入性操作、机械通气、气管插管、广谱抗生素使用、住院时间、ICU环境、意识障碍或昏迷、使用受体拮抗剂或制酸剂等。
单个菌株作为院内感染暴发流行的起源通常与机械通气装置和医务人员的手传播有关。很多研究表明医院环境是鲍曼不动杆菌生存和生长的适宜处所。似乎有与其他革兰氏阴性杆菌不同的特性提高了它的生存适应能力。美国纽约一项研究表明在社区采集的AB菌和在医院环境采集的AB菌不同，医院环境中细菌易播散，而且社区环境一般不会产生耐药菌，因此与耐药菌作斗争的战场最主要的是在医院[23]。医务人员需严格执行无菌操作,进行诊疗操作及护理病人前后均应认真洗手, 切断交叉感染的传播途径。
05年国外有项通过对院内碳青霉烯类敏感菌及同源耐药菌的研究，阐述了水解碳青霉烯类的苯唑西林酶（CHDL）和碳青霉烯类耐药菌的关系，基因型分析显示没有抗生素选择压力下的敏感菌，CHDL编码基因缺失。因而控制抗生素的使用，避免滥用可能在预防耐药中起着重要作用[24]。
Cisneros等分析了西班牙一些医院的AB菌产生亚胺培南耐药的主要潜在危险因素，包括医院病床＞500张、抗生素使用、使用导尿管、外科手术等，建议注意区分细菌定殖和细菌感染，避免不恰当使用抗生素是控制耐药的重要措施[25]。
为减少院内Ab的感染和耐药的发生, 还需监测具有危险因素的病人, 采取积极的预防措施,降低医院感染率。如: 积极治疗原发病；避免不必要的侵入性操作；减少住院时间， 尽早脱离ICU环境，最大限度的缩短呼吸机使用时间；呼吸器严格消毒,及时清除呼吸道分泌物,保持呼吸道通畅等。