正链RNA病毒基因组复制中的宿主因素(综述翻译)

小综述
正链RNA病毒基因组复制中的宿主因素
　　 所有的病毒与他们的宿主是基因弱相关性的，宿主细胞编码成千上万个基因，而最大的病毒基因组也只编码数百个基因。因此，在病毒感染过程中，大多都包括少量不同病毒成分与更多也更为复杂的宿主因素的相互作用。宿主因素形成大海般环境是病毒为生存所必须适应的，同时也是病毒复制的巨大的、可利用的资源库。因此，宿主因素在病毒感染的多数步骤中起着重要作用。长久以来，确定这些宿主因素及他们的重要作用被认为是个重要的前沿研究，接下来的关于病毒与宿主在感染中的整体作用说明，病毒与宿主孤立的观点正逐步向将病毒－感染细胞作为统一整体并组成感染过程中的功能单位的观点转变。
　　宿主因素的重要性正增加表现的一个方面是正链RNA病毒的复制，正链RNA病毒约占病毒总分类的１／３以上，包含数量众多的病原体。例如急性呼吸窘迫综合症的SARS病毒、丙型肝炎病毒(HCV)，以及许多列于U.S. Health and Human Service Department Select List of potential bioterrorism agents上的病毒，在病毒侵入、病毒基因表达、装配、释放过程中，宿主因素即使未参与全部步骤，也参与了其中大部分。另外，宿主因素是PSV调节宿主基因表达和防御的目标靶。
　　本综述着眼于宿主因素与正链RNA病毒复制的关系，不同的基因学和生物化学进展为此提供了证据。这些研究包括基于某些细胞类型对RNA复制的不同允许性和选录性的研究，关于宿主蛋白的识别与复制是功能上相联系的，这种识别与病毒基因和蛋白的复制是相互影响的，以及遗传模板体系的突变。例如在拟南芥和酿酒酵母菌属，最近的数据显示宿主因素在RNA病毒复制复合物装配、RNA复制模板的选择和重组、激活RNA合成复合物及其他步骤中具有重要意义。每一个这种病毒－宿主之间的相互作用可能导致种属特异性、组织特异性及感染的病理，同时也为病毒控制或有希望地更好利用病毒及其成分提供了一个潜在的靶点。
　　正链RNA病毒根据其能被区分的RNA复制基因和特征被划分为几个超家族。尽管如此，这些病毒的RNA复制机制大体是相似的，这使得将他们的复制作为一个类别来讨论具有合理性，并且尝试通过对比不同超家族的样例来描述一个常规的过程。在下面进一步深入探讨正链RNA病毒所共有的一部分特征，这是协调运用感染病毒基因作为转录、复制、复制复合物在细胞内膜装配的模板以及生成10－100折叠的超正链的负链RNA的需要。
　　图１是正链RNA病毒复制的示意简图，下面我们用一些病毒的例子来讨论宿主因素在RNA复制过程各阶段的影响。鉴于篇幅有限，再次激动人心的领域所作的全部工作，我们很遗憾不能全部引用。
翻译和RNA复制
　　正链RNA病毒的基因是翻译和复制的模板，这导致宿主翻译因素与RNA复制之间的相互作用是多水平的。众所周知，正链RNA病毒的基因转运是靠基因复制中的RNA依赖的RNA多聚酶。但是，与其他RNA病毒不同，正链RNA病毒并不能多聚酶壳体化，因此，在感染一个新的细胞后，直到染色体DNA被翻译成多聚酶后，病毒的RNA复制才开始。对于大多数正链RNA病毒而言，膜的靶向定位、模板重组、RNA加帽及其他功能都是所需的。脊髓灰质炎病毒和其他某些病毒的RNA复制要求顺式翻译，这提供了基因组功能方面的部分确实，宿主因素涉及病毒翻译及病毒对翻译的占领已在其他地方提及（６、１２）。
　 宿主因素能够对病毒翻译进行广泛的调解，或者能对特异性病毒因子进行选择性的翻译调节，这对RNA复制至关重要，如正链RNA病毒α病毒属中的成员BMV病毒，它指导着RNA复制、mRNA亚基因的转录、以及病毒在酵母菌中的装配，酵母菌的基因研究已证实BMV RNA的复制需要某些宿主因素的参与，如宿主的DED1基因，编码所有的酵母菌mRNA作用在翻译起始阶段的解螺旋酶。虽然DED1是一个必需的基因，但仍会在缺乏细胞生长抑制时发生BMV RNA的复制DED1基因的块突变，该基因快与BMV翻译多聚酶选择性丢失有关，并与５｀端向下调节翻译多聚酶的顺式作用序列相联系，该解螺旋样的 RNA复制因子由单独的BMV基因组RNA翻译而来。对于其他许多正链 RNA病毒和逆转录病毒，类似的多聚酶水平的向下调节相对于其他复制因子对于有效翻译至关重要，这体现在翻译移码或破读机制中，而不是在翻译起始。正链RNA病毒与逆转录病毒的更多相似之处记录于下。除了翻译的调控以外，某些正链RNA病毒利用宿主的反转途径来调节相关复制因子的累积。虽然病毒的RNA基因组必须首先被翻译，但５`-3`核糖体交通阻断了病毒RNA 3`-5`的福祉。因此，在复制始动因子形成后，正链RNA病毒必须从翻译膜板转而充当复制的模板，当病毒RNA5`端有三叶草结构，在宿主与病毒因子复合物的相互作用下，脊髓灰质炎病毒的翻译和负链RNA的合成协调统一起来。该复合物包含宿主的poly(c)和poly(a)结合蛋白（分别为PCBP和PABP），还含有多聚酶前体3CD。在感染早期，PCBP和PABP分别和5`及3`端RNA相作用并相互促进翻译。在感染后期，３CD累积，并与5`端有三叶草结构相作用，定位于PCBP-PABP-RNA复合物，在RNA3`端促进负链RNA合成的初始化，脊髓灰质炎病毒RNA3`未编码区域与另一个宿主RNA结合蛋白核仁素相结合，并对在无细胞系统中脊髓灰质炎病原体的生产抑制起到抑制生物体的免抑反应的作用。因此，在感染早期当病毒RNA和蛋白水平还较低时，核仁素可能有利于一个或多个脊髓灰质炎病毒的相互作用。在脊髓灰质炎病毒感染期病毒复制过程中，核仁素与某些其他宿主蛋白对于病毒从胞核到胞浆的再定位具有重要意义。
　　　在小核糖核酸病毒超家族中，病毒RNA、常规宿主翻译因子及RNA结合蛋白间的相互作用是相似的，与此可知，potyvirus家族中的另一成员的多聚酶与PABP会有相互作用。除此之外，某些potyvirus的5`端基因组链接蛋白与细胞的帽结合蛋白eIF4E或者eIF(iso)4E结合，并且eIF(iso)4E变异块由potyvirus病毒复制，几种在翻译和复制的相互影响中可能的功能作用已被假设提出。
　　类比脊髓灰质炎病毒3CD-RNA的相互作用机制，BMV基因组RNA从翻译到组装依赖于解螺旋酶样的复制因子病毒蛋白１a。该蛋白通过顺式作用识别要素（REs），对每段病毒RNA起到作用。类似于脊髓灰质炎病毒5`端三叶草结构, REs对于BMV基因组RNA１和２定位于病毒5`端，而BMV　RNA３含有一个内部的REs，可能是与其5`端相作用。病毒RNA１a蛋白的有效重组依赖于宿主基因LSM1, LSM1编码保守的Sm动机蛋白，它与其它的Sm动机蛋白形成复合物，作用于RNA反转及其它过程。在对脊髓灰质炎病毒翻译和复制进行更深层次的类比后，最近的结果显示LSM1和Sm复合物在mRNA翻转结束时，也需要BMV基因组RNA为复制而翻译结束，这与BMVRNA翻译和复制相连接。有趣的是，正链RNA Qβ噬菌体的病毒合成也包含一个宿主Sm蛋白－Hfq，他调节某些细菌mRNA的翻转。除了１a 和LSM1之外，BMVRNA重组可能包含与tRNA相作用的宿主蛋白，REs 包含保守序列和TψC茎环结构，并且这些功能对于１a对REs的有效反应都是必需的。
　　　在翻译因子与活性病毒RNA复制复合物的联合中，其他的联系正被发现。从被BMV或烟草花叶病毒感染的细胞中发现，宿主翻译始动因子的亚单位eIF3于病毒特异性的RdRp复合物联系在一起。一个42kD的eIF亚单位与BMV RdRp一起被协同分离出来并与BMV 2a多聚酶相作用。纯化的eIF3或41kD的亚单位通过BMV RdRp刺激负链的合成。TMVRNA复制蛋白与宿主eIF３的亚单位GCD10相作用并共同免疫沉淀，而抗GCD10抗体抑制负链的合成。这些宿主因素可能与TMV和BMV基因组RNA 3`端 tRNA样的要素的氨基酰化有关，或者与BMV REs的tRNA茎环结构的模板重组信号有关，或者兼而有之。
　　 在复制前后，病毒RNA需要受到保护，免遭胞内5`端和3`端核酸外切酶的RNA降解，细胞的mRNA和许多病毒的RNA通过5`端帽结合蛋白及3`端PABP受到保护，从而对抗翻转通路，而对于缺少5`端帽的脊髓灰质炎病毒而言，其稳定性有赖于与宿主PCBP与5`端有三叶草结构相结合。相反的，许多缺少3`端poly A尾的病毒RNA却有3`端第二终末结构能够结合宿主蛋白，这使得RNA免遭3`端核酸外切酶的破坏。综上所述，BMV及其他某些正链RNA病毒的RNA有着多功能的3`端tRNA样结构，这些3`端tRNA样结构与翻译始动因子相结合，在核苷酸转移酶的作用下成熟，核苷酸转移酶将为结上模板的核苷酸加在BMVRNA上，对于保持病毒3`端起到一个端粒酶样的作用。病毒RNA3`端tRNA样CCAOH结构是宿主氨酰基tRNA合成酶的基质，他就像一个tRNA一样，酯化一个特异性的氨基酸给3`羟基（对于BMV而言是酪氨酸）。
膜联RNA复制复合物的装配
　　所有特征性的正链RNA病毒在细胞内膜上装配他们的RNA复制复合物，并与膜小泡结构或其他重组单位相联系。例如，许多α病毒样超家族的RNA复制常发生在50-70nm球形套叠的细胞内膜处。最近有关BMV等病毒的研究结果显示，这种结构、装配及复制复合物的功能与逆转录病毒体有相似平行的关系。具体来说，BMV解螺旋酶样的1a蛋白与逆转录病毒的Gag蛋白在衣壳装配中的作用很相似，它们都诱导球形套叠的形成，并能选择性的将病毒基因组RNA包装起来。每个囊膜衣壳像发芽一样，产生球形套叠并部分进入内质网，在其中含有数百个1a蛋白。BMV顺式作用REs作为病毒特异性的包装信号，这与逆转录病毒也具有现实性的关系。如果BMV2a多聚酶协同表达，部分2a混合进入每个衣壳的球形体，之后将成为负链和正链RNA病毒合成的场所。最终的复制复合物包含的多聚酶的比例1a/2a大致为25:1，这与逆转录病毒衣壳中的Gag/GagPol比例相当。
　　　对于复制复合物而言，宿主胞膜构成一个极其重要的、多功能的宿主因素。首先，胞膜为复制因子的装配定位和聚集提供了场所，胞膜也围绕和保护病毒诱导的复制小体。这与芽生病原体很相似，在此RNA复制因子和RNA基因组被从竞争RNA模板和竞争翻译等过程中分离出来，这种组织结构也帮助保护dsRNA复制中间复合物对抗dsDNA诱导的宿主防御反应，例如RNA干涉或者干扰素诱导的反应。因此RNA复制复合物构成一个新的膜包绕小体，有着特异性成分和功能，所以他被认为是RNA复制的病毒特异性的细胞器。
　　　许多正链RNA病毒形成相似的球形套叠，而其他的形成明显的膜结构，其中包含小泡的变体，或者紧贴在膜上。这种改变的膜重组的结构可能在聚集和分离RNA复制因子的模板方面有相似作用，虽然他们的具体结构仍未清楚，可能与球形复合体有拓补相似关系。
　　　不同的病毒装配他们的复制复合物是不相同的，但常常是膜特异性或亚单位膜特异性的。例如α病毒利用核内膜和溶酶体膜，BMV用ER膜，noda病毒用线粒体膜，而脊髓灰质炎病毒复制复合物形成在密包小体上，它来源于细胞copⅡ运输通路。虽然许多该靶向定位人不完全清楚，但这些膜特异性的定位一定包含与宿主因素的相互作用。
　　　对于许多病毒复制蛋白来说，膜定位还有赖与于其他病毒蛋白的相互作用。例如，α病毒nsP1 蛋白指导着nsP２、３和４到核内膜，HCV NS4A定位病毒NS３蛋白酶－解螺旋酶到胞核周围的ER。同样的，BMV 1a蛋白与2a多聚酶相互作用并指导其进入ER膜，在相关的cucumber mosaic virus 1a-2a 相互作用被宿主激酶引起的2a磷酸化所打断。该2a磷酸化在体发生并且可能抑制感染中新的复制复合物形成，或者有利于复制复合物中１a与2a的25:1比例维持。对于其他病毒RNA复制蛋白磷酸化的观察，如α病毒nsP3 ，HCV NS5A，可能对于调节复制都有相似的作用。
　　　对于一些病毒而言，宿主膜蛋白至少是暂时的或永久的RNA复制复合物的成分，除了其他的功能外，可能包括装载或维持膜上病毒复制因子的作用，特别引人注意的是，在拟南芥中TMV复制被发生二次变异的宿主整合膜蛋白TOM1及他的同型异构体TOM3所阻断。TOM1与共有的解螺旋酶样区域相作用，该区由重叠的TMV 130-180kDa RNA复制因子组成。TOM1还与TMV复制蛋白及活性RdRp共同分离，TOM１也和TOM2相互作用，TOM2是TMV有效复制所必需的另一宿主整合膜蛋白。
　　　　　　　　　　　　　　病毒RNA合成
　　　在病毒RNA复制因子和模板被装配进宿主膜上的复合物后，某些病毒需要从宿主因素而来的额外因素用于RNA合成的初始化。可沉淀的脊髓灰质炎病毒RNA复制复合物，但其在RNA初始化之前被胍类可逆性抑制分离出来时，需要额外的来自未感染细胞的胞浆因子作为病毒RNA合成的竞争物，脊髓灰质炎病毒在xenopus laevis卵母细胞中的复制需要协同感染的人类细胞的萃取物参与翻译后的步骤，但其所影响的步骤是与上相同还是有所不同并为得知。
　　　相似的是，BMV RNA父子在开始的复制复合物形成装配之后，被酵母菌基因YDJ1所阻断，细胞提供这种YDJ1变以来对正常水平的RNA复制的多个步骤进行支持，其中包括病毒１a蛋白与膜的联结，１a调节病毒RNA复制模板的重组和稳定维护，以及１a调节的病毒2a多聚酶的重组。但是，YDJ1变异的细胞并不支持负链RNA合成的初始化。YDJ1编码一个与Escherichia coli DnaJ相关的分子伴侣，并且部分定位于BMV RNA 的合成部位ER膜。除此之外，在YDJ1变异的酵母菌，但不是野生菌属，发现大量的2a聚合酶在膜中游离但很快沉淀，说明这存在局级。因此，YDJ1伴侣功能可能是介导2a聚合酶折叠或者是RNA合成中必需的相互作用，宿主的分子伴侣也在HCV的蛋白水解中起着作用。其他宿主的基因突变，如OLEI，也阻断BMV RNA副职，该阻断发生在１a、2a多聚酶、病毒RNA与膜连接之后，但在负链RNA合成初始化之前，OLEI是编码９脂肪酸降饱和酶的必须基因，该酶是转化饱和脂肪酸为不饱和脂肪酸的关键酶，它是ER膜整合蛋白并定位于BMV　RNA复制的部位，中间的补充试验显示，BMV　RNA合成并不需要OLEI编码蛋白，而是在不饱和脂酸水平对细胞生长的降低更为敏感，这种对胞膜脂成分的高度敏感性戏剧性的说明膜联结对于RNA复制功能的重要性。这种对于高不饱和脂酸水平的需要也说明复制复合物需要具有重要意义的膜流动性或可塑性，因此复制复合物与宿主膜之间可能存在动态联系。
　　宿主因素可能在多种途径上促成负链RNA合成的初始化，包括对病毒RNA翻译的抑制、激活复制复合物的特异性功能、识别并利用正链RNA３`端作为起始位点，宿主因素可能再利用负链RNA作为模板合成正链RNA中也有相互影响。脊髓灰质炎病毒正链RNA合成需要在未当模板的正链RNA有５`三叶草结构的碱基对。一个值得推荐的建议是负链RNA膜板可能以dsRNA复制形式而作用。新的正链RNA的初始化需要来自dsRNA的负链RNA膜板未配对的３`端，这能被形成三叶草亚结构的互补的５`端所促进，之后依附于宿主PCBP和病毒蛋白而维持其稳定性。
　　黄病毒属西尼罗河病毒负链RNA３`端茎环结构结合了几个宿主蛋白，包括TIAR及它的同型异体TIA-1。宿主RNA结合蛋白在翻译和RNA拼接中起作用，在缺乏TIAR的鼠细胞中，西尼罗河病毒的生长明显降低。因负链RNA的作用目前仅知它是作为复制中间体，TIAR可能对正链RNA的合成有促进作用。冠状病毒结合宿主RNA结合因子hnRNPA1到病毒正链或负链的重要位点，这可能涉及到基因组mRNA的转录和RNA副职，但有关该蛋白的在体功能仍在争论。
总评
　　概括来说，近期出现的结果表明，正链RNA病毒基因组复制和相关感染依赖于广泛的宿主因素。这些因素对于装配、病毒复制复合物的功能及其产物、RNA存在不同的功能作用。但取得重要进展时，许多重要步骤的关键细节将被长鸣，例如复制蛋白和模板对胞内膜的特异靶向性的机制。因此，近期结果可能只揭示了复制所依赖的病毒宿主因素相互作用中很少的一部分，该领域的进展将加速许多进步，其中包括增加所获结果之间的相关性，对蛋白相互作用图谱的进一步明确，以及RNA干涉途径的可利用性，以及其他检测特异性基因产物作用的工具的进步。以往及最近的实验确定，所获得结果不仅对理解和控制病毒特异性的过程有利，而且对于理解更广泛的生物和医学上的许多正常细胞途径也有重要意义。