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核酸基因技术

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一文搞定shRNA实现基因敲低（knockdown）（以pLKO.1质粒为例）

GBhouse医疗行业从业者

1 基本原理1.1 RNA干扰技术 RNA干扰(RNA interference, RNAi) 现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物mRNA 存在同源互补序列的双链RNA(double strand RNA, dsRNA) 导入细胞后，利用载体把shRNA导入细胞，载体中的U6或H1启动子确保shRNA的表达，shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA，然后siRNA结合到RNA诱导沉默复合物上（RNA induced silencing complex，RISC），该复合物能够结合到目的mRNAs并将其降解，从而产生相应的功能表型缺失。 RNA

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福建师范大学曾雪梅：增强胆固醇消耗的铜掺杂空心普鲁士蓝纳米颗粒抑制乳腺癌转移

小威师姐已认证的机构号

1. 研究背景：肿瘤的生长与转移高度依赖于代谢重编程，尤其表现为对葡萄糖、丙酮酸、胆固醇及脂肪酸等营养物质摄取和利用的显著增强。这种代谢适应性不仅是肿瘤侵袭和扩散的关键驱动因素，也使其成为对抗原发灶和难治性转移的潜在治疗靶点。在转移性前列腺癌、肺癌及乳腺癌中，胆固醇代谢异常活跃，并直接参与调控肿瘤细胞的迁移与侵袭过程。胆固醇通过参与脂筏形成、调控膜性质、影响免疫细胞功能等多种机制促进癌症进展。具体而言，它可激活Wnt信号通路以驱动肿瘤细胞增殖与分化，同时借助脂筏激活RAS-MAPK信号通路，进而通过上皮-间质转化（EMT）促进细胞迁移。此外，胆固醇代谢产物27-羟基胆固醇也被证实能够显著增强肿

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复旦大学王宇翔团队：Prickle4驱动肿瘤微环境重塑并介导IDH突变胶质瘤对PARP抑制耐药

小威师姐已认证的机构号

[第一段：研究背景]胶质瘤是最常见的原发性脑肿瘤，标准治疗包括手术切除联合放化疗，但复发几乎不可避免。近年来，随着分子病理学的发展，异柠檬酸脱氢酶（IDH）突变被确认为重要的预后标志。IDH突变可产生2-羟基戊二酸（2-HG），干扰DNA和组蛋白去甲基化，从而诱发同源重组修复（HR）缺陷及复制压力。这使得IDH突变胶质瘤被视为“BRCAness”肿瘤，理论上可对PARP抑制剂（PARPi）高度敏感。然而，实际治疗与动物实验中发现，虽然早期有效，但多数肿瘤很快产生耐药性并复发。这种“假敏感—再生长”模式提示：肿瘤可能通过复杂的微环境适应机制逃逸PARPi压力。[第二段：] 复旦大学王宇翔课题组联

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dPCR拷贝数计算器--软件小工具分享

风中飞叶医疗行业从业者

随意测试下:下载地址:https://mp.weixin.qq.com/s/WDxcSUwdGvpgFx65Czc8KA

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精准计算DNA/RNA拷贝数----软件小工具分享

风中飞叶医疗行业从业者

在分子生物学实验中，我们经常需要计算DNA或RNA的拷贝数——无论是进行qPCR定量、构建质粒，还是进行各种核酸检测，准确的拷贝数计算都是实验成功的关键一环！告别繁琐计算，一键搞定分子生物学实验中的拷贝数计算难题~GHS手搓一款完全免费的DNA/RNA拷贝数计算工具：工具特点：1.全面支持：单链DNA、双链DNA、单链RNA、双链RNA四种类型；2.原理透明：每种分子的计算公式和原理清晰展示，方便验证；3.操作日志：完整记录计算历史，便于追溯和复核；4.标准格式：结果以标准科学计数法显示，符合规范。用电脑上任意的网页浏览器，即可打开使用，无需联网，本地化使用~下载地址：https://mp.w

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pcr数据处理神器～小工具分享

风中飞叶医疗行业从业者

做pcr估计遇到过:面对数十板、上百板的PCR原始数据，分别需要统计出各板中的样本Ct值时，相信每个人都是比较崩溃的：一板一板打开，一个一个孔誊抄？每板都打开，分别导出Excel，再进行各种转置、删减？尤其是多重荧光PCR，荧光通道多，更是统计到崩溃~现在分享一个pcr数据处理神器小工具下载地址:https://mp.weixin.qq.com/s/Z3Lzg_l0n6oi0fQa7SVuGA

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求购plem415

dxy_uzlgzm80动物学其他学科医学生

有没有plem415质粒，可以购买，有完整正确的序列图谱的

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酶切连接构建载体一直连接不上

芝麻糊糊b微生物学医学生

切入DNA片段1385bp，载体4729bp跑胶看亮度，片段大概10ng/ul，载体大概40ng/ul片段加了15ul，载体2ul，buffer2ul，T4连接酶1ul，摩尔比大概1:6.5。为什么一直连接不上呢？amp板上一个单克隆都没有卡在这个实验已经一个月多了真的头秃了！求帮助！

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菌落PCR气溶胶污染

我爱噬菌体流行病学医学生

如图所示，菌落PCR假阳性，气溶胶污染咋办，已经试过生物安全柜消毒，分区做，换移液枪，还是这个样子

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在293t细胞里同时转染了以下两种质粒，48小时后还没有看到红色荧光，质粒构建有问题？

Axinne基因组学医学生

在293T细胞里分别转染T7启动子质粒和T7 RNA聚合酶质粒，转染48h后还没有红色荧光出现，请问是质粒构建出现了问题吗？

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请大家帮我看看这样的T7质粒可以在真核生物中被T7 RNA聚合酶启动转录吗？

Axinne基因组学医学生

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sanger测序分析

dxy_crfzry43

最近遇到了一个这样的图，原因是什么呢？哪位大神能解答一下

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luciferase实验内参差异太大

Yoda医学生基础医学其他学科医学生

最近做luciferase实验，是用双荧光报告系统做的，研究转录因子和下游promoter区是否有调控作用。RNA-seq和体内KO，OE均倾向于转录因子对于下游promoter区有正向调控作用。用luciferase验证的时候，实验组Lucifer的荧光值与对照组相比确实有上升，但实验组renilla的值却成倍下降，导致最后趋势看不出来了。想问问做过类似实验的大家这是什么原因呢？细胞数，转染量都严格控制着，转染体系也是一起配的。按道理讲，内参不应该差这么多的啊（10倍以上的变化）

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同源重组法构建细菌基因缺失，电转PCR验证后，单交换这一步pcr跑不出条带了

阿望ROAZ医学微生物学医学生

请教各位大神，本人最近在用同源重组的原理敲除革兰阴性菌的某基因，用的是温敏性自杀质粒，已经顺利构建好质粒，用的是电转的方法将质粒导入该菌的感受态中，用PCR方法成功筛选出转入质粒的菌，且条带明亮，增菌几小时后稀释接种到含抗生素的平板于43度过夜培养，平板上长出很多菌落，按原理的话，如果发生质粒与细菌染色体发生单交换后，应该能PCR能扩出小片段，没成功至少也有大片段嘛。但是有几次43度筛选后，同样的引物，反应条件和体系却跑不出条带，就很疑惑，请问这是什么原因造成的呢？救救孩子，卡在单交换这一步，快两个月了

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Ensemble查询基因页面关键词释义-你知道多少？

GBhouse医疗行业从业者

（图1 ensemble基因查询页面提醒关键词）第一部分：基因序列的功能区域这些术语描述了一个基因的DNA序列中不同功能的部分。Translated sequence--翻译序列解释：指DNA序列中最终会被核糖体翻译成蛋白质氨基酸序列的那一部分。它等同于“编码序列”。Coding sequenc--编码序列解释：基因中直接指定蛋白质氨基酸序列的核苷酸序列。它从起始密码子开始，到终止密码子结束。CDS不包括内含子。UTR--非翻译区解释：信使RNA中不被翻译成蛋白质的部分，但对基因表达调控至关重要（如mRNA的稳定性、定位和翻译效率）。它分为两个部分：5‘ prime UTR：位于编码序列的上游

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三种点杂交教程---dot blot protocol

花匠是自己医疗行业从业者

点杂交也叫斑点印迹实验（spot blot/dot blot）将蛋白样品/DNA样品/RNA样品点到尼龙膜或硝酸纤维素膜（NC）上，通过紫外交联/或者恒热干燥使样品吸附到尼龙膜/NC膜上，再通过探针杂交或者抗体吸附对样品进行定性定量分析。目前斑点杂交按样品类型分主要有三种，核酸表观遗传修饰印迹（甲基化/羟甲基化印迹）、单链DNA/RNA印迹、蛋白斑点印迹。前两种都做过，第三类尚未尝试。下图是近期自己文章的图，看多了长条带，看看这些圆点型条带感觉很舒适！Sun D, Qin Z, Xu Y, et al. The IVF-generated human embryonic microenviro

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【求助】QPCR 罗氏lc96分析软件使用

晕乎yun

大家好，我第一次在用lc96做相对定量pcr，使用其配套软件进行数据分析。但是我遇到了以下几个问题：1我的ratio和ratio error 这一栏没有任何数字显示，如下图，这样子正常嘛。2.根据说明书操作后，ratio bars 是没有柱状图出现的。3.扩增效率在哪个位置看呀，完全没有找到。谢谢

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m6A甲基化修饰检测手段

红红丫头ye医疗行业从业者

各位大神，请教一下m6A甲基化修饰检测手段中总体m6A测量和m6A斑点印迹分析有什么区别？使用这两种方法的适用情况是什么，还有能不能提供一下m6A斑点印迹分析的操作步骤？谢谢各位大神！

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EMSA|Electrophoretic Mobility Shift Assay-DNA&Protein 互作证明实验

花匠是自己医疗行业从业者

以前的帖子讲过有激光扫描仪的实验平台做EMSA可以节省很多时间，因为不用进行转膜和抗体孵育等等。对于没有激光扫描仪的实验室，应该按照免疫学方法进行EMSA实验。念书的时候实验室设备比较完善，所以有幸使用激光扫描进行EMSA实验，工作后平台没有设备，于是摸索了免疫学方法。（上图为念书时做的激光扫描方法得到的最后结果）用免疫法做EMSA在引物设计时就得开始改变修饰策略，在引物设计时偶联上能与抗体或辣根过氧化物酶体等免疫复合物结合的修饰标签。如生物素标记，可以在探针合成的时候让公司偶联上去，也可以购买生物素标记试剂盒自己偶联标记。（下图是生工合成修饰添加页面）实验步骤：探针退火、非变性胶的制作、样

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细菌引物设计选择rpob基因序列可行吗

dxy_4m9uqzy9医学遗传学医学生

想设计几个模式细菌的特异性引物，遇见了几个疑问1.根据文献选择了rpob基因(或者是必须用16s rRNA吗) 下载其序列导入prime-blast设计引物，这样方法对吗2.设计一个针对一个属的细菌的引物，这个是选择基因(16s rRNA 或者rpob)保守区序列进行设计吗这个保守区的选择具体要如何筛选？求解答！

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16sqpcr绝对定量标准品选用大肠杆菌DNA,计算标准品拷贝数时候公式里的片段长度是什么

dxy_4m9uqzy9医学遗传学医学生

计算标准品拷贝数时候copies/ul=(浓度9.110*11)/片段bp，这里bp数指的是多少，是全基因dna长度410*6还是16s基因的长度1542bp，是不是还要算全基因里面有7个16s重复。求解答

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常见16 种 RNA 结构及其功能介绍，为什么你的研究是某一类特定RNA

GBhouse医疗行业从业者

有证据表明 RNA 在生命史上早于 DNA，在这个古老的世界，RNA 是万事通。它可以携带遗传指令，也可以像酶一样发挥作用，引发生命所需的反应。（图1 生物界核心遗传调控分子）地球上的每一种生物—从最小的微生物到最高的树，从最简单的病毒到人类的复杂性——都是建立在编码在分子中的指令之上的，这些分子非常小，以至于肉眼看不见。然而，这些分子以惊人的精确度控制着生命的编排。这场分子芭蕾的核心是两个重要的参与者：DNA 和 RNA。RNA 的核糖具有额外的氧原子，使其反应性更强，因此更适合短期角色。RNA 通常是单链的，尽管它可以折叠成复杂的形状。双螺旋使 DNA 变得刚性和保护性;RNA的灵活性使其

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qPCR上样求助

可燃冰可乐临床医学医学生

求助各位科研大佬，我最近开始做肿瘤方面的RT-qPCR实验，通过收集大概100例病人的肿瘤组织和癌旁正常组织，更别对ABC三个基因进行检测。想要达到的目标是：1.分别得到三个基因在不同临床样本之间的差异（促癌或抑癌）。2.分别得到每个基因的表达对肿瘤临床参数的关系（比如基因表达量越高肿瘤分期分级越高）。我现在的问题是我想要按照一个标本做3个复孔，一个板子上把这个样本的内参、ABC三个基因同时做了，但是小导非要说这样不对，要我设置2个复孔，用4个板子，每个板子用尽可能多的样本只检测一个基因，这样子把三个基因和内参分别做了。想问一下各位大佬，这样做是合乎规范的嘛。